CYP2C19基因多态性对颈动脉支架植入术后支架内血栓形成的影响

董靖德　靳凌　张丽



CYP2C19基因多态性对颈动脉支架植入术后支架内血栓形成的影响

董靖德靳凌张丽

目的阐明CYP2C19基因多态性与颈动脉支架植入术(CAS)后支架内血栓形成、氯吡格雷抵抗之间的关系。方法入选2013年1月至2014年12月南京医科大学附属脑科医院老年神经科及神经科接受颈内动脉动脉支架(裸支架)植入术的首次住院颈内动脉狭窄患者102例,服用阿司匹林100 mg/d,颈内动脉支架植入术前3 d开始予氯吡格雷 75 mg/d口服。多重高温连接酶检测反应进行CYP2C19*2和*3位点分型,并记录氯吡格雷抵抗和支架内血栓形成的发生率。结果入选的102例患者中,按CYP2C19*2分型:CYP2C19*1*1型45例,CYP2C19*1*2型47例,CYP2C19*2*2型10例。携带CYP2C19*2基因者氯吡格雷抵抗的发生率为26.3%(15例),未携带CYP2C19*2基因者氯吡格雷抵抗的发生率为13.3%(6例),组间差异有统计学意义(P<0.05)。携带CYP2C19*2基因者颈内动脉支架植入术后支架内血栓形成的发生率为19.3%(11例),未携带CYP2C19*2基因者支架内血栓形成的发生率为11.1%(5例),组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论CYP2C19*2基因位点的多态性可能是颈内动脉支架植入术后不良事件发生的危险因素。

颈动脉支架植入术; CYP2C19基因多态性; 氯吡格雷抵抗; 支架内血栓形成

为了预防颈动脉支架植入术(CAS)后支架内血栓形成及其他不良事件的发生,阿司匹林联合氯吡格雷的双联抗血小板治疗已经成为CAS术后常规治疗方案[1]。然而并不是所有CAS术后的患者都能从双联抗血小板治疗中获益,部分患者在CAS术后6～12月支架内会再次出现血栓形成。研究表明氯吡格雷通过细胞色素酶P450(CYP450)在其抗血小板聚集中起到了重要作用[2]。目前尚无研究报道CYP2C19基因多态性与CAS后支架内血栓形成是否相关。本研究旨在阐明CYP2C19基因多态性与CAS后支架内血栓形成、氯吡格雷抵抗(CR)发生率之间的关系,为CAS术后抗血小板个体化治疗提供一定的依据。

1　资料与方法

1.1研究对象均为来自2013年1月至2014年12月南京医科大学附属脑科医院老年神经科接受颈内动脉支架(裸支架)植入术的首次住院颈内动脉狭窄患者，共102例,颈内动脉狭窄率≥70%。排除标准:有抗血小板药物过敏史;严重的肝肾疾病或心功能Ⅲ级以上;肿瘤;凝血功能异常;有出血倾向或3月内有出血史;既往有颅内出血病史;血小板计数<80×109/L;其他不适宜使用氯吡格雷的情况。所有患者需签署知情同意书。

1.2研究方法所有患者均予阿司匹林100 mg/d,颈内动脉支架植入术前3 d开始予氯吡格雷 75 mg/d口服。

1.3基因型的检测和患者的分组患者入院后经知情同意抽取外周静脉血5 ml于抗凝管中,-80 ℃超低温冻存。提取全血DNA,并将浓度标化至10 ng/ml,通过多重高温连接酶检测反应进行基因分型,CYP2C19*2的引物为F: AACCAGAGCTTGGCATAT,R: AGCAATCAATAAAGTCCC;CYP2C19*3的引物F: ACTTTCATCCTGGGCTGTG;R: AGGGCTTTGGAGTTTAGTG。聚合酶链式反应(PCR)条件为95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,扩增36个循环;最后72 ℃ 7 min,4 ℃,最后对PCR产物进行基因测序。设立空白对照样本和5%的重复样本,以评价检测结果的可靠性,对于基因型不明确的重新进行测定。根据CYP2C19基因分型结果对患者进行分组CYP2C19*2(*1*1;*1*2;*2*2)和CYP2C19*3(*1*1;*1*3)。

1.4血小板聚集功能检测服用氯吡格雷≥5 d后取静脉血4.5 ml,加至含0.5 ml枸橼酸钠溶液(1∶9)的采样管中混匀,3 h内检测血小板聚集功能。用LTA(540VS,Chronolog公司,美国)检测血小板聚集功能。将待测血样经200 r/min离心8 min,获取富血小板血浆(PRP),检测血小板计数;将剩余血样经2465 r/min 离心10 min,获取去血小板血浆(PPP),用 PPP 将 PRP 的血小板计数稀释至250×109个/L。以 PPP 为空白对照,将校正的 PRP样本置于光学血小板聚集仪的检测槽,加入2.5 μl二磷酸腺苷(ADP),使ADP 终浓度分别至5 μmol/L,测定8 min 最大血小板聚集率(PL)。将5 μmol/L ADP诱导的残余血小板聚集率(PLADP)>40%定义为CR[3]。

1.5随访和终点事件通过门诊、电话、住院等在术后6、12月进行随访,此后每年随访1次。随访截止时间为2015年6月。临床终点事件为颈动脉彩超检查发现支架内血栓形成。

1.6统计学分析采用SPSS 16.0软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析;计数资料以频数和率表示,组间比较采用卡方检验或Fisher精确概率法。卡方检验比较单个基因型及基因频率,以判断基因型的哈迪-温伯格遗传平衡符合程度。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1患者一般资料比较患者年龄50～80岁,平均(65.1±12.1)岁。根据不同基因型分组后,各组患者的临床资料见表1。无论CYP2C19*2基因型分组还是CYP2C19*3基因型分组,各组患者在年龄、性别、卒中、冠心病、高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟、饮酒等方面差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1　不同基因型分组患者的临床资料

2.2基因分型按CYP2C19*2分型:CYP2C19*1*1型45例,CYP2C19*1*2型47例,CYP2C19*2*2型10例;按CYP2C19*3分型: CYP2C19*l*1型94例,CYP2C19 *1*3型8例。CYP2C19*2和CYP2C19*3的最小等位基因频率分别为31.9%和3.8%。基因分布频率均符合哈迪-温伯格平衡(P>0.05)。

2.3CR发生率CR的总发生率为20.6%(21例)。按患者是否携带CYP2C19*2基因分组后,携带CYP2C19*2基因者的CR的发生率为26.3%(15例),非携带CYP2C19*2基因者的CR的发生率为13.3%(6例),组间差异有统计学意义(P<0.05)。按患者是否携带CYP2C19*3基因分组后,2组在CR的发生率上差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4支架内血栓形成随访结果患者随访期为(15.6±7.2)月,其中16例患者发生了支架内血栓形成,发生率为15.7%。按患者是否携带CYP2C19*2基因分组后,携带CYP2C19*2基因者CAS后支架内血栓形成的发生率为19.3%(11例),非携带CYP2C19*2基因者支架内血栓形成的发生率为11.1%(5例),组间差异有统计学意义(P<0.05)。按患者是否携带CYP2C19*3基因分组后,2组在CAS后支架内血栓形成的发生率上差异无统计学意义(P>0.05)。

3　讨论

氯吡格雷主要通过CYP450酶系代谢转化为有活性的物质,从而产生抗血小板聚集作用。CYP450酶系中的CYP2C19在氯吡格雷代谢转化中起着重要作用。本研究表明携带CYP2C19*2基因者CR的发生率明显高于非携带组。氯吡格雷的抗血小板作用受到多方面因素的影响,如个体差异、药物相互作用、依从性和剂量等。对于CR是否受CYP2C19基因的影响,国内刘倩等[4]研究发现CYP2C19基因检测为慢代谢基因型(*2/*2、*2/*3、*3/*3)的患者发生CR的概率明显高于快代谢型(*1/*1)及中间代谢型(*1/*2、*l/*3),携带CYP2C19慢代谢基因是发生CR的危险因素。王雷等[5]研究表明CYP2C19基因多态性可影响急性脑梗死患者氯吡格雷治疗的疗效。我们的研究结果与该研究结果类似。但Namazi等[6]的研究认为,CYP2C19、P2Y12等基因多态性与CR无关,说明CYP2C19与CR之间的关系需要进一步研究。

本研究结果表明:携带CYP2C19*2基因者CAS后支架内血栓形成的发生率明显高于非携带组。Li等[7]发现在中国人中，CYP2C19基因多态性与亚临床血栓的发生有关,并且认为CYP2C19基因多态性是支架内血栓惟一的独立预测因子,而与血栓形成关系密切的为CYP2C19*2基因。Sawada等[8]对日本100例支架植入术后的患者进行随访研究,接受氯吡格雷治疗患者出现血栓与CYP2C19*2基因多态性有关。Mega等[9]对9685例有过急性冠脉综合征或经皮冠状动脉介入治疗患者的Meta分析表明,CYP2C19功能缺失基因携带者的卒中风险明显升高,并且支架内血栓形成的不良事件增多。Yamamoto等[10]认为CYP2C19基因多态性可能与残留血小板的高反应性及心血管事件的高发生率有一定的关系。2013年临床药理协会(CPIC)指南建议尽早对急性冠脉综合征或经皮冠状动脉介入术后患者行CYP2C19基因型检测,尤其是携带CYP2C19*2功能缺失基因的患者群体,应尽早干预,防止不良事件发生[11]。

综上所述,携带CYP2C19*2基因组术后的CR以及血栓形成的发生率高,常规给予CAS的患者检测CYP2C19*2基因有助于患者更好地预防CR及术后支架内血栓的再形成,从而减少颈内动脉支架术后的不良事件。但本研究入组的患者人数有限,故结果有一定的局限性,需要在今后的工作中累积更多的病例。

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Effect of CYP2C19 gene polymorphisms on stent thrombosis after carotid artery stent placement

DONGJing-de,JINLing,ZHANGLi.

DepartmentofGeriatricNeurology,theBrainHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China

ObjectiveTo clarify the relationship of CYP2C19 gene polymorphisms with stent thrombosis and the clopidogrel resistance after carotid artery stent(CAS) placement.MethodsOne hundred and two patients who firstly underwent carotid artery stent placement from January 2013 to December 2014 were enrolled in the department of neurology and geriatric neurology of Nanjing Brain Hospital. They were treated with aspirin 100 mg/d and clopidogrel 75 mg/d three days before CAS placement.CYP2C19 genotype was detected by improved multiple ligase detection reaction. The incidence rate of clopidogrel resistance and stent thrombosis was observed respectively.ResultsOf the 102 patients, 45 were wild-type homozygous, 47 were heterozygotes, and 10 were homozygous. The incidence rate of clopidogrel resistance was 26.3% (15 cases) in patients with CYP2C19 * 2 gene, and 13.3% (6 cases) in patients without CYP2C19 * 2 gene, and the difference between two groups was statistically significant (P<0.05). The incidence rate of stent thrombosis was 19.3% (11 cases) in patients with CYP2C19 * 2 gene, and 11.1% (5 cases) in patients without CYP2C19 * 2 gene, and the difference between two groups was also statistically significant (P<0.05).ConclusionsCYP2C19 * 2 loci polymorphism may be a risk factor for adverse events after CAS placement.

carotid artery stent placement; CYP2C19 genetic polymorphism; clopidogrel resistance; stent thrombosis

江苏省卫生厅课题(H201241)

210029江苏省南京市，南京医科大学附属脑科医院老年神经科

张丽，Email: 1374714800@qq.com

R 743.9

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2016.08.019

2015-09-15)