肝癌患者单个核细胞线粒体DNA拷贝数与抗氧化能力的变化*

高　园， 聂鸿靖， 杨　栋， 丁诚实,2， 金　敏，谌志强， 邱志刚， 郭　旋， 陈照立Δ， 李君文Δ

(1. 军事医学科学院卫生学环境医学研究所， 天津 300050； 2. 枣庄学院， 山东枣庄 277160)



肝癌患者单个核细胞线粒体DNA拷贝数与抗氧化能力的变化*

高园1， 聂鸿靖1， 杨栋1， 丁诚实1,2， 金敏1，谌志强1， 邱志刚1， 郭旋1， 陈照立1Δ， 李君文1Δ

(1. 军事医学科学院卫生学环境医学研究所， 天津 300050； 2. 枣庄学院， 山东枣庄 277160)

目的：探讨肝癌患者单个核细胞(PBMC)线粒体DNA(mtDNA)拷贝数的变化及其与机体抗氧化能力的关系。方法：用FicollHypaque 离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，采用实时荧光定量PCR反应，检测线粒体NADH脱氢酶亚基1(ND1)基因的拷贝数，并以核基因组的β-actin作为内参基因，比较25例肝癌患者与30例健康人外周血单个核细胞中mtDNA拷贝数的差异。流式细胞术检测单个核细胞活性氧(ROS)含量的变化。生化检测法检测血浆中总抗氧化能力(T-AOC)的变化。结果：肝癌组外周血单个核细胞ND1基因拷贝数是健康对照组的73%，表明肝癌患者外周血单个核细胞mtDNA拷贝数明显下降。肝癌组单个核细胞活性氧含量的平均荧光强度为(417.82±110.62)，健康对照组为(301.82±75.54)，肝癌组单个核细胞活性氧含量显著高于健康对照组(P<0.01)。肝癌组血浆总抗氧化能力(单位/毫升血浆)吸光度为(1.30±0.85)，健康对照组为(3.20±1.62)，肝癌组血浆总抗氧化能力显著低于健康对照组(P<0.01)。结论：肝癌患者的外周血单个核细胞线粒体DNA拷贝数减少可能与机体抗氧化水平下降有关。

肝癌；线粒体DNA； 活性氧；总抗氧化能力；单个核细胞

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝脏最常见的原发性恶性肿瘤[1]，在我国，肝癌是危害居民生命健康前3位最主要恶性肿瘤之一，我国肝癌具有发病率高、危害性大、病死率高等特点[2]。细胞免疫功能在肝癌患者抗肿瘤免疫中发挥重要作用。已有研究证实，肝癌患者细胞免疫功能受抑制，淋巴细胞是机体主要的免疫细胞，其必须有能量的供给才会有活性。

线粒体是细胞内产生ATP的主要场所，在能量代谢、氧自由基生成及细胞凋亡调节中起重要作用。ATP的产生主要依赖于呼吸链的完整性与氧化磷酸化功能的正常。线粒体DNA( mitochondrial DNA，mtDNA)是唯一存在于细胞器中且相对独立的基因组，其在基因组中的个数称为mtDNA拷贝数。与核基因组相比，mtDNA没有组蛋白保护，缺乏抗氧化机制和有效的修复系统，并且接近线粒体内膜电子传递链，极易受周围活性氧类(reactive oxygen species，ROS)的损伤，当ROS超过内源性抗氧化防御系统的消除能力时，氧化/抗氧化失衡，会导致氧化应激的出现。在氧化应激作用下，mtDNA拷贝数可能升高或降低[3]。mtDNA缺失后复制速度时常会发生变化，这可能正是造成线粒体功能失常的重要原因之一[4]。因此提高肿瘤患者体内的抗氧化能力,减少自由基产生,对疾病的治疗与预后均有很大帮助。近年来研究发现，mtDNA拷贝数变化与骨质疏松、糖尿病、心血管疾病、肿瘤等多种疾病的发生发展有一定的相关性[5-8]。目前，对恶性肿瘤中mtDNA突变的研究已经成为一个快速发展的领域，并且已经发现几乎在所有肿瘤中均存在mtDNA的突变，mtDNA突变的形式多种多样。已有研究证实，mtDNA在胃癌组织中的拷贝数是下降的[9]。而对于肝癌患者血液细胞mtDNA拷贝数的变化与体内抗氧化能力变化的关系却鲜有报道。

本实验利用实时荧光定量PCR、流式细胞仪和生化检测法，检测了肝癌患者单个核细胞中mtDNA的拷贝数、活性氧含量和血浆总抗氧化能力，旨在了解它们的变化情况，探讨其变化在肝癌发生、发展中的作用以及相互关系，为进一步阐明线粒体功能异常与肿瘤的发生机制的关系提供一定的理论依据。

1　材料与方法

1.1试剂与材料

人外周血淋巴细胞分离液(Ficoll 1.077 g/ml)购自北京索莱宝公司；CM-H2DCFDA购自美国Life Technologies公司；总抗氧化能力(total-antoxidant capability，T-AOC)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；DNA提取试剂盒为TIANGEN公司产品；SYRB荧光定量试剂盒购自Applied Biology，引物合成由上海生工生物科技有限公司完成。

1.2研究对象

为2014年11月～2015年3月天津市肿瘤医院初次住院肝癌患者血液25例，平均年龄(43.1±8.8)岁。对照组为同期中国人民解放军第272医院门诊健康体检人员血液30例，平均年龄(41.3±8.4)岁。样本收集过程遵循“赫尔辛基”宣言,得到收集对象知情同意，采集静脉血2 ml(EDTA抗凝)。

1.3仪器

流式细胞仪FACSCalibur购自美国BD公司。超级酶标仪uQuant 200-999型购自美国伯腾(BioTek)仪器有限公司。实时荧光定量PCR仪7300型购自美国ABI公司。蛋白核酸测定仪Gene Quant 1300型购自美国GE公司。

1.4实验方法

1.4.1实时荧光定量PCR检测mtDNA的拷贝数取EDTA-K2抗凝血2 ml，用人外周血淋巴细胞分离液提取外周血单个核细胞，用TIANGEN公司血液/细胞基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA(包括mtDNA)。通过NADH脱氢酶亚基1(ND1)来确定mtDNA的数量，选用β-actin作为看家基因，ND1以及β-actin引物序列列于表中(表1)，实时荧光定量PCR反应体系为20 μl：SYRB的PCR混合液(含dNTP，Mg2+，Taq酶，PCR缓冲液等)10 μl，灭菌水7 μl，模板DNA 2 μl，10 μmol/L的上、下游引物各0.5 μl。PCR扩增条件为：先经过95℃ 10 min预变性，再进入95℃ 15 s，60℃ 1 min的40个循环，然后进行融解曲线分析。分别计算内参基因与待检基因样本的Ct均值差ΔCt(差值均一化)，求出肝癌组与健康对照组的ΔCt差值ΔΔCt，求值(2-ΔΔCt)得出肝癌组ND1基因与核β-actin基因拷贝量的变化比率。

Tab. 1　Sequence of primers of real-time PCR products

1.4.2细胞活性氧含量测定提取单个核细胞后，PBS洗涤2次，收集细胞，DCFH-DA用DMSO溶解，用改良型RPMI-1640培养基稀释至终浓度为10 μmol/L，细胞重悬于DCFH-DA探针中，37℃避光负载20 min，每隔3～5 min颠倒混匀一下，阳性药物组继续加1～2 μl阳性药物Rousp，继续刺激细胞20 min，阳性药物组与探针组PBS 洗2次，200目尼龙网过滤，流式细胞仪激发光波长488 nm检测，每个样品收集10 000个细胞，Cell Quest软件分析吸光度值。1.4.3提取血浆与总抗氧化能力分析EDTA-K2抗凝血5 000 r/min，离心5 min，吸取上层血浆，用南京建成公司T-AOC测定试剂盒于520 nm处测定吸光度值。血浆总抗氧化能力计算公式为：

1.5统计学处理

2　结果

2．1肝癌患者单个核细胞mtDNA拷贝数变化

2.1.1单个核细胞基因组DNA提取结果所得DNA溶于TE缓冲液中，DNA样本经蛋白核酸蛋白分析仪检测，每一例DNA的OD 260/280的比值均≥1.7，DNA纯度较高符合实验要求。基因组DNA提取后进行0.8%琼脂糖凝胶电泳实验，结果显示条带清晰，仅含与预期目的片段大小一致的条带，无其他产物出现，说明DNA纯度较高，适合进行后续荧光定量PCR反应(图1)。

Fig. 1Agarose gel electrophoresis of genomic DNA

M：λ-Hind Ⅲ digest DNA mark； 1：Healthy control group； 2：Hepatocellular carcinoma(HCC)group

2.1.2实时荧光定量PCR结果各组单个核细胞提取DNA与相应引物进行实时荧光定量PCR反应，得出肝癌组与对照组的ND1和β-actin的扩增曲线与溶解曲线，扩增曲线呈明显的S型曲线，表明所有样品的目的产物呈指数扩增，即扩增效率为100%，扩增反应良好；由溶解曲线可以看出PCR反应引物具有较好的特异性，无引物二聚体、非特异性PCR产物和污染的存在(图2)。

Fig. 2Amplification curves and dissociation curves of fluorescence quantitative PCR of ND1 and β-actin gene

A：Amplification curves of healthy control group； B：Dissociation curves of healthy control group； C：Amplification curves of hepatocellular carcinoma(HCC)group； D：Dissociation curves of HCC group; HCC: Hepatocellular carcinoma

分析30例健康人与25例肝癌患者外周血单个核细胞mtDNA ND1基因和内参基因β-actin的荧光定量相对表达水平，结果显示，在健康对照组mtDNA ND1基因相对表达水平为1时，肝癌患者外周血单个核细胞的mtDNA ND1基因相对于健康对照组ND1基因的表达变化率为73%，提示肝癌患者外周血单个核细胞mtDNA ND1基因表达明显降低(表2)。

Tab.

HCC: Hepatocellular carcinoma

2.2流式细胞仪测定单个核细胞活性氧含量

DCFH-DA负载后,Cell Quest软件检测分析得到的流式细胞术直方图。由A阴性对照组“画门”去除细胞本底荧光值，由B可以看出阳性药物处理后荧光强度较强，表明活性氧增多，证明探针可以与活性氧相互作用。图C与图D比较可以看出肝癌组平均荧光强度高于正常对照组，表明肝癌患者细胞活性氧含量增多(图3)。平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)分析结果显示：肝癌组细胞内活性氧含量高于健康对照组(P<0.01，表3)。

Fig. 3Mean fluorescence intensity(MFI)of ROS in different groups

A：Negative control group； B：Positive control； C：Healthy control+probe； D：HCC+probe； ROS：Reactive oxygen species

2.3生化检测法测定血浆总抗氧化能力

在波长520 nm，1 cm光径，测定对照管与测定管吸光度值。正常人对照管吸光度值(A值)为(0.13±0.01)，测定管A值为(0.15±0.02)。肝癌组对照管A值为(0.10±0.03)，测定管A值为(0.09±0.03)。T-AOC肝癌组血浆总抗氧化能力明显低于健康对照组，差异有统计学意义(表3，P<0.01)。

GroupnMFIofROST-AOC(Unit/mlplasma)Control30301.82±75.543.20±1.62HCC25417.82±110.62**1.30±0.85**

HCC: Hepatocellular carcinoma; T-AOC: Total antoxidant capability; PMBC: Peripheral blood mono-nuclear cell

**P<0.01vscontrol group

3　讨论

原发性肝癌是目前世界上致死率最高的恶性肿瘤之一,在全世界范围内的发病率有逐年上升的趋势。肿瘤的发生是一个多种信号网络相互参与调节的复杂过程，随着进程的继续，肿瘤细胞逐渐表现出无限增殖、抵抗凋亡、逃避免疫监督、侵袭与转移以及出现异常的代谢途径等标志性特征。细胞免疫功能在肝癌患者抗肿瘤免疫中发挥重要作用。有研究发现，抽取肝癌患者外周血进行检测可以观到CD4+和CD4+/CD8+比值较正常人群明显下降，提示肝癌患者细胞免疫功能受抑制[10]。

线粒体是细胞有氧呼吸的基地和供能的场所，供应细胞生命活动95%的能量，线粒体受到损伤，细胞就会因缺乏能量而死亡，从而导致淋巴细胞丧失其免疫功能，有利于癌症的发生和发展。已知mtDNA与细胞氧化磷酸化功能密切相关,由于mtDNA缺少组蛋白保护所以易受内源性损伤因子和外源性致癌物质的攻击而使mtDNA发生变化[11]。有研究发现，线粒体呼吸链氧化磷酸化不但与mtDNA的序列变化密切相关,还与其拷贝数相关。线粒体DNA突变能引起线粒体呼吸酶复合体的缺陷，从而增加患癌的风险。通过测序来自于不同部位的早期肿瘤的mtDNA基因序列发现:64%的膀胱癌病人、46%的头颈肿瘤病人及43%的肺癌病人的体液样本存在着mtDNA的突变。这些突变最常见于NADH脱氢酶亚单位4(ND4)的基因和D-loop上。本实验通过对肝癌组和健康对照组的mtDNA拷贝数变化进行检测,结果表明肝癌组mtDNA拷贝数是健康对照组的0.73倍，表明肝癌患者mtDNA拷贝数下降。与文献报道的胃癌mtDNA拷贝数下降的结论类似。

已有研究证实mtDNA的突变可引起电子转运元件的改变，从而影响正常的电子传递，导致氧化磷酸化系统功能障碍，生成大量的活性氧[12]。内源性活性氧的升高可以导致细胞内脂、蛋白和DNA等的氧化损伤，诱发氧化应激，继而导致肿瘤的发生发展[13]。机体中存在多种抗氧化物，包括抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等，可以清除体内产生的各种活性氧，以阻止氧化应激的产生。一个体系内的各种抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶总的水平即该体系的总抗氧化能力。T-AOC是机体清除自由基的重要指标，它的测量结果克服了单一的抗氧化指标难以全面反映血浆抗氧化能力的不足。本实验通过检测肝癌患者与健康对照组单个核细胞ROS含量与血浆总抗氧化能力发现肝癌患者细胞活性氧含量高于健康对照组，血浆总抗氧化能力低于健康对照组，证明肝癌患者体内氧化抗氧化体系发生失衡。

因此,肝癌患者体内存在外周血单个核细胞mtDNA拷贝数的下降与机体抗氧化体系的失衡，二者可能在肿瘤的发生、发展过程中起着重要的生理和病理作用，但是具体的途径和信号传导过程还不清楚,有待进一步研究。

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Changes of the mitochondrial DNA copy number and the antioxidant system in the PBMC of hepatocellular carcinoma

GAO Yuan1, NIE Hong-jing1, YANG Dong1, DING Cheng-shi1,2, JIN Min1, SHEN Zhi-qiang1,QIU Zhi-gang1, GUO Xuan1, CHEN Zhao-li1Δ, LI Jun-wen1Δ

(1. Institute of Health and Environmental Medicine， Academy of Military Medical Sciences， Tianjin 300050；2. Life Science College， Zaozhuang University， Zaozhuang 277160， China)

Objective: To investigate the relationship between the changes of the copy numbers of mtDNA in peripheral blood mono-nuclear cell(PBMC) and the disordered of antioxidant capacity of hepatocellular carcinoma(HCC) patients． Methods: The Ficoll Hypaque method was used to isolate the PBMC from blood specimens. The ND1 gene of the mitochondrial was amplified by real-time PCR；meantime β-actin was served as a quantitative standard marker; the difference of mtDNA copy number in PBMC was compared between HCC and healthy control group．The level of reactive oxygen species(ROS) in PBMC was determined by flow cytometry．The change of total antioxidant capacity (T-AOC) of plasma was detected by the biochemistry examination. Results: The copy numbers of ND1 gene in PBMC of HCC was 73% that of the healthy control group，which suggested a decrease of the copy numbers of mtDNA in HCC．The levels of ROS of PBMC in HCC was (417.82±110.62) and (301.82±75.54) in control group，which showed that the levels of ROS of PBMC in HCC were significant higher than that in control group(P<0.01)．Plasma T-AOC in HCC was (1.30±0.85)，and (3.20±1.62) in control．The T-AOC of plasma of HCC was significantly lower than in control group(P<0.01)． Conclusion: There was a certain relationship between the decrease of the copy numbers of mtDNA and the disordered antioxidant capacity in hepatocellular carcinoma, which may beassociated with the development of hepatocellular carcinoma．

hepatocellular carcinoma；mtDNA；ROS；T-AOC；PBMC

国家自然科学基金资助项目(81471812)

2015-03-20

2015-06-26

△Tel：022-84655288, 022-84655345； E-mail：zhaolichen@126.com, junwen9999@hotmail.com

R735.7

A

1000-6834(2016)01-001-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.001