呼吸道合胞体病毒F蛋白二级结构分析及其B细胞表位预测

易高，潘嘉宇，林纯意，刘兆宇

(广州医科大学附属第五医院，广州510700)



呼吸道合胞体病毒F蛋白二级结构分析及其B细胞表位预测

易高，潘嘉宇，林纯意，刘兆宇

(广州医科大学附属第五医院，广州510700)

目的分析呼吸道合胞体病毒(RSV)F蛋白的二级结构并预测其B细胞表位。方法分析RSV F蛋白的二级结构，得出RSV F蛋白中可能出现的信号肽序列以及位置。基于同源建模的方法预测RSV F蛋白的三级结构，以三级结构为基础预测F蛋白中可能存在的构象B表位和线性B表位。结果F蛋白的574个编码氨基酸中占主要比例的是丝氨酸(10.45%)、亮氨酸(10.28%)、天冬酰胺(8.71%)和苏氨酸(8.71%)；可能有7个蛋白结合位点、6个产生螺旋结构的区域；可能存在两个主要的β-折叠片蛋白；F蛋白N-末端第1～25区段为信号肽。RSV F蛋白头部主要由β-折叠片、无规则卷曲和转角组成，尾部主要由两段长的α-螺旋组成。RSV F蛋白中可能存在4个构象B表位、8个线性B表位。结论F蛋白编码氨基酸主要为丝氨酸和亮氨酸，可能有7个蛋白结合位点、6个产生螺旋结构的区域、两个主要的β-折叠片蛋白。 RSV F蛋白中可能存在4个构象B表位、8个线性B表位。

呼吸道合胞体病毒；F蛋白；蛋白二级结构；B细胞表位

呼吸道合胞体病毒(RSV)是一种常见婴幼儿气道感染和炎症的病原体[1,2]。研究发现，RSV感染是诱发哮喘的危险因素，其致病性远超其他微生物病原体[3]。研究和开发RSV疫苗、抗体药物以及检测试剂盒具有重要的临床意义。RSV属于副黏液病毒科，是一种不分节段的单股负链RNA病毒。RSV基因组大小约为15 kb，共编码10种不同的病毒蛋白，其中NS1蛋白、NS2蛋白和SH蛋白为RSV非结构蛋白，而G蛋白、F蛋白、M1蛋白、M2蛋白、P蛋白、L蛋白、N蛋白等7种蛋白为RSV结构蛋白[4]。G蛋白和F蛋白是RSV的两个表面糖蛋白，能促进机体保护性抗体的表达[5,6]。G蛋白又称为附着蛋白，在病毒吸附到宿主细胞表面的过程中发挥作用，而F蛋白是一种融合性包膜糖蛋白，在病毒包膜与宿主细胞膜融合过程中发挥作用[7,8]。不同RSV亚型之间G蛋白变异较大，而F蛋白相对比较保守，不同亚型之间同源性较高，针对F蛋白产生的抗体在不同亚型之间具有交叉保护作用，因此一般以F蛋白作为开发疫苗、诊断试剂的研究对象[9]。本研究通过分析RSV F蛋白的二级结构，预测其可能的B细胞表位，旨在为RSV疫苗、治疗性抗体及诊断检测试剂盒的开发奠定基础。

1　材料与方法

1.1RSV F蛋白二级结构分析

1.1．1RSV F蛋白氨基酸序列从GenBank中选取近年来在越南南部地区分离的RSV基因组序列(登录号：KJ939966)为研究对象[10]，获得RSV F蛋白编码基因及氨基酸序列，F蛋白基因位于5651、7375，核苷酸长度为1 725 bp，氨基酸长度574 aa，氨基酸序列为MELPILNTNAITTILAAVTLCFTSSQ-NITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI-KENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQS-TPAANSRARRELPRFMNYTLNNTKNTNVTLSKKRKR-RFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALL-STNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK-QSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPV-STYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQ-SYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLC-TTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETC-KVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKI-MTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIK-TFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLY-VKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFI-RKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGL-LLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN。

1.1.2RSV F蛋白的二级结构分析通过蛋白结构在线预测网站Predict Protein Server(http://www.predictprotein.org/)分析F蛋白的二级结构，对F蛋白的氨基酸组成以及蛋白序列中可能存在的蛋白结合区域、α-螺旋区域、β-折叠区以及其他不规则区域进行分析，同时预测蛋白结构中可能的暴露区域和隐藏区域。

1.1.3RSV F蛋白的信号肽分析通过在线服务器上的信号肽预测软件SignalIP 3.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)，采用神经网络算法(NN)和隐马尔可夫模型(HMM)分析RSV F蛋白中可能出现的信号肽序列以及位置。

1.2RSV F蛋白三级结构及B细胞抗原表位的预测基于同源建模的方法，通过在线服务器软件SWISS-MODEL(http://www.swissmodel.expasy.org/)预测RSV F蛋白的三级结构，并通过PyMOL Viewer分析并输出预测的三级结构。综合比较分析上述方法，以RSV F蛋白的三级结构为基础，采用Ellipro(http://tools.immuneepitope.org/ellipro/)在线服务器程序预测F蛋白中可能存在的构象B表位，得分大于0.5(软件默认值)则预测为优势构象B表位。选取亲水性强、表面可及性好以及抗原性高的区域作为线性B细胞表位预测的备选区域，并且排除序列中的N-末端的信号肽序列、C-末端跨膜区及位于病毒囊膜内部的序列。Ellipro服务器软件预测F蛋白中可能存在的线性B表位，得分大于0.5(软件默认值)则预测为优势线性B表位。

2　结果

2.1RSV F蛋白二级结构F蛋白的574个编码氨基酸中占主要比例的是丝氨酸(S,10.45%)、亮氨酸(L,10.28%)、天冬酰胺(N,8.71%)和苏氨酸(T,8.71%)，见图1。可能蛋白结合位点有7个，主要位于蛋白N-末端第100～135、260～350、400～430区段；可能产生螺旋结构的区域有6个，分别为N-末端第29～48、82～96、134～233、377～385和490～550区段；可能存在两个主要的β-折叠片，分别位于N-末端第275～374和395～475区段；此外，在蛋白中还可能包含有1个跨膜结构区域(N-末端第525～545区段)和1个小的无序结构(N-末端第126～128区段)。整个蛋白暴露区域和隐藏区域均匀相间分布，无大片段暴露区域或者隐藏区域，见图2。

2.2RSV F蛋白信号肽RSV F蛋白的信号肽预测结果见图3；NN(图3A)和HMM(图3B)结果表明F蛋白N-末端第1～25区段为信号肽。

2.3RSV F蛋白三级结构、B表位根据SWISS-MODEL同源建模结果表明RSV F蛋白分为较大的头部和细长的尾部组成，头部主要由β-折叠片、无规则卷曲和转角组成(暴露于病毒囊膜外，容易形成抗原表位)，而尾部主要由两段长的α-螺旋组成，并且包括跨膜区(镶嵌于病毒囊膜内部，难以形成抗原表位予以排除)。经过Ellipro预测分析表明RSV F蛋白中可能存在4个构象表位：表位①由N-末端第61～108、110～112、198～225、227～228、231、234～235、291～295区段组成，该表位的得分为0.702；表位②由N-末端第114～133、141、146区段组成，表位得分为0.678；表位③由N-末端第421、423～435、444～449、451、453～454、456、458～461区段组成，表位得分为0.609；表位④由N-末端第264～269区段组成，表位得分为0.533，见图4。F蛋白存在8个潜在线性B表位，分别位于N-末端第61～134、198～228、178～186、418～435,152～166,291～295、264～269和444～464区段，各个表位的预测得分分别为：0.728、0.721、0.649、0.621、0.618、0.569、0.533、0.515。

图1　RSV F蛋白氨基酸组成

图2　RSV F蛋白二级结构

3　讨论

RSV是引起婴幼儿感染并诱发支气管炎、肺炎的常见病原，几乎所有的儿童都都有经历过一次或者多次感染，对人们的生活、工作造成了极大的威胁[11]。疫苗的研制和应用是目前用于防治病毒感染最为有效的手段，表位疫苗由于制备简单、效果突出、毒副作用小等特点而成为新型RSV疫苗研制的热点和趋势[12～14]。抗原优势表位的确定是疫苗研制、临床应用的基础，其所采用的方法主要有结构测定、免疫学鉴定和生物信息学等方法，前两种由于比较耗时耗力，周期较长而在具体的表位疫苗研制开发中应用较少，生物信息学方法简单可靠而越来越受到研究者的信赖和关注[15～18]。基于疫苗开发、单克隆抗体制备以及快速检测试剂盒的开发，采用生物信息学方法对RSV中的一些关键性蛋白进行二级结构和B细胞表位的预测具有重要的意义。

注：图A为NN对RSV F蛋白信号肽的预测结果；图B为HMM对RSV F蛋白信号肽的预测结果。

图3RSV F蛋白信号肽预测结果

图4　RSV F蛋白三级结构和构象B细胞抗原表位。

F蛋白是RSV编码的一种多功能膜蛋白，在病毒侵染融合过程中发挥关键作用[19]。相对于RSV编码的其他膜蛋白而言，F蛋白在不同亚型之间保守性较高，针对F蛋白产生的抗体在不同的亚型之间具有交叉反应，因此针对F蛋白开发相关的表位抗体在RSV的诊疗都具有较为重要的意义。B表位由线性表位和构象表位组成，蛋白中α-螺旋、β-折叠等二级结构由于结构比较稳定、键能高，并且通常处于蛋白质分子的内部而很难形成抗原表位与相应的抗体分子结合；无规则卷曲、转角等二级结构由于结构较为松散，容易发生构象改变，并且通常处于蛋白质结构的表面而往往易于形成与抗体发生结合的稳定位点，因此这些位置往往易于形成抗原B表位[20,21]。另外，蛋白的疏水性区域往往位于蛋白的内部，而亲水性区域位于蛋白表面。因此在蛋白质潜在抗原表位预测过程中，必须要综合考虑亲水性、表面可及性、柔韧性等，避免疏水区域、α-螺旋和β折叠区域[22,23]。在本研究中，我们首先通过Predict Protein Server，结果显示F蛋白中可能包含有6个产生螺旋、2个产生β折叠片的区域，另外还包含有7个可能的蛋白质相互作用位点(见图2)，提示F蛋白可能参与多种蛋白或其它分子之间的相互作用并在RSV感染过程中发挥重要作用，可对F蛋白的相关功能位点进行深入研究，进一步的揭示RSV的侵染机制。在预测了F蛋白二级结构的基础上，我们又通过Swiss-model预测了F蛋白的三级结构，并通过Ellipro Prediction对F蛋白中可能的线性B表位和构象B表位进行了预测，结果表明F蛋白中存在较多的线性B表位和构象B表位(见图4)，这可能与RSV F蛋白分子量较大、结构较为复杂相关。对于进一步的确认F蛋白的优势表位信息，需要通过体外试验、动物模型等来进行验证，本研究预测的相关线性表位、构象表位将为下一步F蛋白抗原表位的确证、诊疗抗体的开发等提供一定的依据和参考。

基于上述研究结果，我们将在下一步的研究工作中通过构建RSVF蛋白的表达载体，开发能对RSV进行快速检测的胶体金试剂盒。通过参考上述的B细胞表位预测结果，合成部分优势表位序列用于尝试构建和制备针对F蛋白的人源化单克隆抗体，为RSV感染的治疗性抗体开发奠定基础。

[1] Nair H,Nokes DJ,Gessner BD,et al.Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children: a systematic review and meta-analysis [J].Lancet,2010,375(9725):1545-1555.

[2] 董琳,李海燕.呼吸道合胞病毒感染治疗的研究进展[J].中华妇幼临床医学杂志(电子版),2014(4):30-33.

[3] Piedimonte G.Respiratory syncytial virus and asthma: speed-dating or long-term relationship? [J].Current Opinion Pediat,2013,25(3):344-349.

[4] Hall CB.Respiratory syncytial virus and parainfluenza virus [J].Neng Jour Med,2001,344(25):1917-1928.

[5] Anderson LJ,Bingham P,Hierholzer JC.Neutralization of respiratory syncytial virus by individual and mixtures of F and G protein monoclonal antibodies [J].Jour Virolo,1988,62(11):4232-4238.

[6] Palomo C,Garcia-Barreno B,Penas C,et al.The G protein of human respiratory syncytial virus: significance of carbohydrate side-chains and the C-terminal end to its antigenicity [J].Jour Gene Virolo,1991,72( Pt 3):669-675.

[7] Teng MN,Collins PL.The central conserved cystine noose of the attachment G protein of human respiratory syncytial virus is not required for efficient viral infection in vitro or in vivo [J].Jour Virolo,2002,76(12):6164-6171.

[8] 张枫,谢正德.呼吸道合胞病毒F基因及蛋白的相关研究进展[J].病毒学报,2015,32(2):201-206.

[9] Brandenburg AH,van Beek R,Moll HA,et al.G protein variation in respiratory syncytial virus group A does not correlate with clinical severity [J].Jour Clinic Microbiolo,2000,38(10):3849-3852.

[10] Do LA,Wilm A,van Doorn HR,et al.Direct whole-genome deep-sequencing of human respiratory syncytial virus A and B from Vietnamese children identifies distinct patterns of inter- and intra-host evolution [J].Jour Gene Virolo,2015,119:3470-3483.

[11] Welliver RC.Review of epidemiology and clinical risk factors for severe respiratory syncytial virus(RSV)infection [J].Jour Pediat,2003,143(5 Suppl):S112-117.

[12] Karron RA,Ambrosino DM.Respiratory syncytial virus vaccines [J].Pediatric Infect Dis Jour,1998,17(10):919-920.

[13] Girard MP,Cherian T,Pervikov Y,et al.A review of vaccine research and development: human acute respiratory infections [J].Vaccine,2005,23(50):5708-5724.

[14] Girard MP,Osmanov SK,Kieny MP.A review of vaccine research and development: the human immunodeficiency virus(HIV)[J].Vaccine,2006,24(19):4062-4081.

[15] El-Manzalawy Y,Honavar V.Recent advances in B-cell epitope prediction methods [J].Immunome Res,2010,6( Suppl 2):S2.

[16] De Groot AS,Sbai H,Aubin CS,et al.Immuno-informatics: Mining genomes for vaccine components [J].Immunology Cell Biology,2002,80(3):255-269.

[17] 杨军,刘妮,张婷,等.HBeAg的B细胞线性表位预测及鉴定[J].病毒学报,2013,33(2):253-257.

[18] 蒋建平,王来,李宜川,等.肠道病毒71型VP1外壳蛋白二级结构及B细胞表位预测[J].山东医药,2009,49(35):10-12.

[19] Kahn JS,Schnell MJ,Buonocore L,et al.Recombinant vesicular stomatitis virus expressing respiratory syncytial virus(RSV)glycoproteins: RSV fusion protein can mediate infection and cell fusion[J].Virology,1999,254(1):81-91.

[20] Reineke U,Schutkowski M.Epitope mapping protocols,2nd edn[M].New York: Humana Press,2009:135-139.

[21] Rodrigues RN,Martins JH,Singh B,et al.In silico identification and validation of a linear and naturally immunogenic B-cell epitope of the plasmodium vivax malaria vaccine candidate merozoite surface protein-9[J].PLoS one,2016,11(1):e0146951.

[22] Sun P,Ju H,Zhang B,et al.Conformational B-cell epitope prediction method based on antigen preprocessing and mimotopes analysis[J].Comput Math Meth Med,2013,2013(1217):529-543.

[23] Mahdavi M,Mohabatkar H,Keyhanfar M,et al.Linear and conformational B cell epitope prediction of the HER 2 ECD-subdomain III by in silico methods[J].Asian Pacific Jour Can Prevent,2012,13:3053-3059.

Secondary structure and prediction of B cell epitope of F protein in respiratory syncytial virus

YI Gao,PAN Jiayu,LIN Chunyi,LIU Zhaoyu

(The 5th Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510700,China)

ObjectiveTo analyze the secondary structure and predict its B cell epitope of F protein in respiratory syncytial virus(RSV).MethodsWe analyzed the secondary structure of RSV F protein and obtained the sequence and location about the signal peptide in RSV F protein.Based on the homology modeling method,we predicted the potential conformational B epitopes and linear B epitopes in RSV F protein.ResultsAmong the 574 amino acids of RSV F protein,the major amino acids were serine(10.45%),leucine(10.28),asparagine(8.71%)and threonine(8.71%).There might be 7 protein binding sites,6 helical structure generation regions and 2 β-plated sheets in F protein.The sites 1-25 of N-terminus in F protein were signaling peptides.The head of the F protein was mainly composed by β-plated sheets,random coils and turns,while the tail was mainly composed by 2 long α-helixes.Eight linear B epitopes and four conformational B epitopes were predicted in F protein.ConclusionsSerine and leucine occupy the maximum ratio of amino acids encoding F protein.There might be seven protein binding sites,six helical structure generation regions,two major β-plated sheets in F protein,and RSV F protein may contain four conformational B epitopes and eight linear B epitopes.

respiratory syncytial virus;F protein;secondary structure of protein;B cell epitope

国家自然科学基金青年科学基金项目(81400013)；广东省科技计划自助项目(2014A020212329)。

易高(1977-)，男，硕士，副主任医师，主要研究方向为气道炎症与气道疾病。E-mail：15360802191@163.com

简介：刘兆宇(1983-)，男，博士，助理研究员，主要研究方向为先天性免疫与气道疾病。E-mail：sysu1924@gmail.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.006

R392.11

A

1002-266X(2016)27-0020-04

2016-02-11)