细胞自噬诱导剂雷帕霉素对小鼠小胶质细胞线粒体ROS表达及炎性细胞因子分泌水平的影响

刘娜，董晓莉，叶俊丽，姜忠信

(1 青岛大学附属医院，青岛266003；2 香港理工大学深圳研究院；3 青岛大学医学院)



细胞自噬诱导剂雷帕霉素对小鼠小胶质细胞线粒体ROS表达及炎性细胞因子分泌水平的影响

刘娜1，董晓莉2，叶俊丽3，姜忠信1

(1 青岛大学附属医院，青岛266003；2 香港理工大学深圳研究院；3 青岛大学医学院)

目的观察细胞自噬诱导剂雷帕霉素(RAPA)对脂多糖(LPS)激活的小鼠小胶质细胞线粒体ROS表达及肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-1β( IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-12(IL-12)等炎性细胞因子分泌水平的影响。方法小鼠小胶质细胞分为A、B、C组，分别加入100 ng/mL LPS+10 nmol/L RAPA 、100 ng/mL LPS、等量细胞培养液培养24 h。采用MitoSOX RED荧光染色测定各组线粒体ROS水平采用ELISA法检测各组细胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12水平。结果A、B、C组细胞线粒体ROS水平(RFU值)分别为36.417±3.456、74.939±1.906、14.784±0.898。组间两两比较，P<0.05。B组细胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6 及 IL-12水平均高于C组(P均<0.05)。A组细胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6 及 IL-12水平均低于B组(P均<0.05)。结论RAPA可降低LPS诱导的小胶质细胞线粒体ROS表达及TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等炎性细胞因子的分泌水平。

细胞自噬；自噬诱导剂；雷帕霉素；小胶质细胞；炎性细胞因子；线粒体；活性氧簇

小胶质细胞是神经胶质细胞的一种，其适度活化对神经突触的发生、神经元结构和功能的维持及调节血脑屏障的完整性具有重要作用。但过度激活的小胶质细胞可释放炎性细胞因子[肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-12(IL-12)]及细胞毒性介质[活性氧簇(ROS)]，导致神经元发生损伤。线粒体是神经细胞能量代谢的主要场所，易受ROS损伤。线粒体自噬功能障碍可导致过量ROS产生，最终导致神经细胞的急慢性损伤及凋亡[1,2]。2014年10月～2015年12月，本研究观察了自噬诱导剂雷帕霉素(RAPA)对脂多糖(LPS)激活的小胶质细胞线粒体ROS表达及TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等炎性细胞因子分泌水平的影响。现将结果报告如下。

1　材料与方法

1.1细胞、药物、材料及试剂小鼠小胶质细胞BV-2由昆明动物研究所提供。四甲基偶氮唑盐(MTT)、RAPA、LPS均购于美国Sigma公司，线粒体红色荧光探针、线粒体绿色荧光探针、购自美国Invitrogen公司,含200 mg/L 的L-精氨酸培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、其他组织培养试剂均购自美国Gibco公司。倒置显微镜(日本Olympus公司),MR700型酶标仪(美国Becton dickinson公司)。

1.2BV-2细胞培养、分组及RAPA用药方法取对数生长期的BV-2细胞，置于含15%热灭活FBS的DMEM培养液中，，5% CO2、37 ℃ 恒温箱培养，细胞生长至密度达80%左右时传代。将细胞分为A、B、C组，分别加入100 ng/mL LPS+10 nmol/L RAPA 、100 ng/mL LPS、等量细胞培养液培养24 h备用。

1.3各组细胞线粒体ROS测定采用MitoSOX RED荧光染色法测定各组线粒体ROS水平。取培养24 h时对数生长期各组细胞，接种于96孔板中，每组9个复孔，PBS洗2 次，按照线粒体ROS检测说明书加入5 μL MitoSOX RED，37 ℃避光孵育10 min。PBS洗涤细胞3 次，采用流式细胞仪检测各组细胞平均荧光强度(RFU)，以RFU代表细胞线粒体ROS水平，RFU值大说明细胞线粒体ROS水平高。采用Cell Quest软件进行数据分析。实验重复3次，取平均值。

1.4各组细胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12检测取对数生长期各组细胞，接种于预敷抗-TNF-α、抗-IL-1β、抗-IL-6和抗-IL-12抗体的96孔板中，PBS冲洗，加入酶标多克隆抗体孵育2 h。冲洗4次，加显色剂孵育30 min，终止液终止反应。所有操作均严格按照使用说明书进行，采用酶标仪检测各组细胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-12在450 nm波长处的吸光度值。 参照试剂盒说明书，建立标准曲线，根据标准曲线得到各组TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-12的分泌量。

2　结果

2.1各组细胞线粒体ROS表达比较A、B、C组细胞线粒体ROS(RFU值)分别为36.417±3.456、74.939±1.906、14.784±0.898，组间两两比较，P均<0.05。

2.2各组细胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12水平比较各组细胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-12水平比较见表1。

表1　各组细胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-12水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05。

3　讨论

当中枢神经系统内稳态发生变化时,小胶质细胞可迅速被激活，吞噬入侵的病原体和受损细胞的残骸，清除有毒代谢产物其活化时刺激分泌的TGF-β、IL-10、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)等抗炎因子和神经营养因子均可提高神经元的防御和修复能力[3]。但过度持续激活的小胶质细胞可产生多种免疫效应分子，如ROS、活性氮(RNS)、促炎细胞因子及蛋白酶等是神经元损伤的重要媒介[4]。自噬是近年来发现的细胞内清除损伤、衰老细胞器以及冗余蛋白的一种重要生理过程，营养和能量缺乏、氧化应激、感染以及蛋白质大量聚集等因素都可以诱导细胞发生自噬。为了避免细胞损伤，细胞内的自噬活动可选择性地清除受损的线粒体等细胞器，对哺乳动物细胞的线粒体质量控制发挥重要的调节作用[5,6]。线粒体自噬功能障碍导可能致过量ROS产生，参与神经细胞的损伤[7,8]。

研究表明，ROS作为胞内参与调节细胞生长、分化、增殖死亡的重要信号分子，是小胶质细胞过度活化的重要介质，其来源主要来自于小胶质细胞呼吸爆发时活化的NADPH氧化酶[9]。线粒体是细胞内ROS的另一重要来源，在小胶质细胞从静止状态到激活的过程中，细胞内mRNA、蛋白表达水平及细胞形态表型等转变都需要充足的能量供应，而线粒体是ATP 生成的主要场所，因此小胶质细胞的活化与线粒体密切相关。线粒体在消耗氧制造ATP的同时必然伴发有ROS的生成，因此小胶质细胞活化时对线粒体高代谢的需求有可能产生高水平的ROS，线粒体中的ROS也可能参与小胶质细胞的过度活化。最近，Schwarz等[10]研究已证实，LPS介导的小胶质细胞活化过程中伴有线粒体ROS的大量产生；特异性抑制剂Mito-TEMPO可显著降低线粒体ROS及胞质内ROS的产生，抑制LPS介导的小胶质细胞活化及炎症反应，提示了线粒体ROS在小胶质细胞异常活化中的重要调控作用。本研究利用可透过线粒体膜结构被超氧阴离子氧化的特异性荧光染料MitoSOX RED作为线粒体ROS指示剂，通过流式细胞术检测MitoSOX RED也发现，LPS单独处理可显著提高小胶质细胞线粒体中ROS水平，提示了线粒体ROS在小胶质细胞活化中重要的调控作用。

线粒体是易受ROS攻击的主要靶细胞器，同时衰老损伤的线粒体可进一步产生ROS。在真核细胞中，自噬是真降解和回收利用细胞内生物大分子和受损细胞器的重要生理过程过程，对细胞的动态平衡和其在营养缺乏时的存活至关重要[11]。线粒体自噬可选择性的清除受损的线粒体，完成对损伤线粒体的降解，维持适当的ROS水平和细胞内环境的稳定。若线粒体自噬功能不足可导致能会导致产生过量的ROS，参与小胶质细胞活化过程。Mizushima等[12]体外培养的小胶质细胞活化模型中证实了自噬现象的存在，发现亚致死量的LPS可抑制细胞凋亡和自噬信号，延长活化的小胶质细胞寿命。以往研究发现[13]，RAPA可抑制小胶质细胞的活化及介导的炎症反应。本研究结果表明，LPS能够诱导小胶质细胞中线粒体ROS的产生，RAPA联合LPS处理线粒体ROS产生水平降低，提示了自噬诱导剂RAPA可能通过影响线粒体ROS水平抑制小胶质细胞的过度活化。

小胶质细胞被LPS激活后，除增殖和形态学变化外，还表现为天然免疫细胞表面受体如CD14、MHC等的表达上调，迁移、吞噬及抗原提呈的功能增强；炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等及蛋白酶、活性氧等炎性介质的分泌增多[14]。已有研究发现，RAPA可抑制LPS激活的小胶质细胞内NOS、NF-κB、COX等炎性因子的表达[15]。TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等是小胶质细胞活化中释放的主要炎性因子，是介导神经损伤的主要介质。为证实自噬调控线粒体ROS进而影响小胶质细胞炎性反应的作用机制，本研究应用ELISA检测了不同处理组小胶质细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6 以及 IL-12的水平。与上述报道相似，本研究结果证实，RAPA联合处理组细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12的水平显著低于LPS单独处理组，提示诱导细胞内的自噬活动可抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症反应[21,22]。

综上所述，RAPA可降低LPS诱导的小胶质细胞线粒体ROS表达及TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等炎性细胞因子分泌水平。其具体作用机制尚有待于后续研究深入探讨。

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国家自然科学基金资助项目(31100824)。

姜忠信(E-mail：jzx99@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.010

R363

A

1002-266X(2016)27-0033-03

2016-01-05)