舒心安神膏灌胃对大鼠自主活动的影响及联合戊巴比妥钠腹腔注射对小鼠睡眠和肌肉协调力的影响

徐福平，梁皓越，林立宇，杨志敏

(1 广东省中医院，广州510120；2 广州中医药大学第二临床医学院)



舒心安神膏灌胃对大鼠自主活动的影响及联合戊巴比妥钠腹腔注射对小鼠睡眠和肌肉协调力的影响

徐福平1,2，梁皓越2，林立宇2，杨志敏1,2

(1 广东省中医院，广州510120；2 广州中医药大学第二临床医学院)

目的观察舒心安神膏灌胃对大鼠自主活动及联合戊巴比妥钠腹腔注射对小鼠睡眠、肌肉协调运动能力的影响。方法将健康SPF级SD大鼠50只随机分为A、B、C、D、E组，每组10只。A、B、C组分别予0.28、0.84、1.40 g/mL的舒心安神膏1 mL/100 g灌胃，1次/d,连续5 d 。D组于给药第5天予2 mg/kg安定灌胃。E组为空白对照组，予1 mL/100 g纯净水灌胃。末次给药60 min后取各组大鼠置于自发活动箱内，记录5 min内直立次数、整毛次数、中央穿格数、总穿格次数；取健康NIH小鼠50只，分为低、中、高剂量组、安定组、空白组各10只。低、中、高剂量组分别予0.205、0.615、1.025 g/mL的舒心安神膏0.2 mL/10 g灌胃，1次/d,连续5 d。安定组和空白组分别于给药第5天予4 mg/kg安定、1 mL/100 g纯净水灌胃。各组分别于末次给药60 min时腹腔注射戊巴比妥钠45(阈上剂量)、40(阈下剂量)mg/kg。观察并计算各组入睡潜伏期和睡眠时间。取健康NIH小鼠50只随机分为1、2、3、4、5组，1、2、3组分别予0.205、0.615、1.025 g/mL的舒心安神膏0.2 mL/10 g灌胃，1次/d,连续5 d。4、5组分别于给药第5 d予4 mg/kg安定、0.2 mL/10 g纯净水灌胃。各组均于末次给药60 min后将各组小鼠置于小鼠转棒仪观察5 min，记录各组小鼠跌落潜伏期和5 min内总跌落次数。结果A、B、C、D组直立次数和中央穿格数均低于E组(P均<0.05)。舒心安神膏协同阈上剂量戊巴比妥钠促进小鼠催眠实验中，低、中、高剂量组、安定组和空白组入睡潜伏期间比较差异无统计学意义。低、中、高剂量组和安定组的睡眠时间均长于对照组(P均<0.05)。舒心安神膏协同阈下剂量戊巴比妥钠促进小鼠催眠实验中，低、中、高剂量组、安定组和空白组的入睡潜伏期分别是(3.89±3.02)、(3.20±4.32)、(2.80±2.14)、(5.30±2.75)、(15±0)min；睡眠时间分别是(36.00±4.53)、(38.00±5.90)、(40.29±7.36)、(36.30±10.32)、0 min。4组跌落潜伏期少于5组(P<0.05),4组跌落次数明显高于其余各组(P均<0.05)。结论舒心安神膏能抑制大鼠自主活动，可协同戊巴比妥钠促进小鼠睡眠，且对小鼠运动协调能力影响较小。

舒心安神膏；大鼠；小鼠；镇静；催眠；肌肉协调运动能力

失眠是最常见的一种睡眠障碍性疾病，通常指患者对睡眠时间或质量不满足，并影响白天社会功能的一种主观体验，长时间的失眠会影响到人们正常的生活、工作、学习与社会交往等[1]。以往临床多采用镇静催眠药、抗焦虑药、抗抑郁药、激素替代疗法等治疗失眠，但服药过程中常出现记忆力和注意力下降、疲倦等不良反应，导致患者生活质量下降，且长期服药易出现戒断反应、耐受性、依赖性。舒心安神膏是我院自主研发的协定膏方制剂，由熟附子、干姜、炙甘草、桂枝、白芍、乌梅、山茱萸和龟板胶等组成，治疗慢性失眠效果较好，特别是对存在注意力无法集中、情绪低落、紧张心悸的患者效果较好。本课题组前期研究发现，舒心安神膏可降低大鼠脑组织5羟色胺(5-HT)、5羟基吲哚乙酸(5-HITT)和去甲肾上腺素(NE)表达[2]，规律性影响斑马鱼的运动行为及睡眠周期[3]。2015年3～8月，本研究观察了舒心安神膏灌胃对大鼠自主活动及联合戊巴比妥钠腹腔注射对小鼠睡眠、肌肉协调运动能力的影响，旨在为临床合理用药提供理论依据。

1　材料与方法

1.1实验动物、药物及仪器SPF级NIH小鼠160只[雌雄各半，体质量(20±2)g，合格证号0101213]、SPF级SD大鼠55只[雌雄各半，体质量(200±20)g，合格证号：0105439]均购自广东省医学实验动物中心，饲养于(20±2)℃的动物房内，自由摄食和饮水，12 h光照/黑暗循环。舒心安神膏为广东省中医院院内制剂，药物批号111203。戊巴比妥钠购自国药集团化学试剂有限公司，批号20090512；安定注射液购自上海旭东海普药业有限公司，产品批号：111101；自制自发活动箱为直径50 cm、高50 cm的方形柱形笼，笼底分为9格；小鼠转棒仪DXP-2，购自Ugo Basile公司，型号Cat.No.47700。

1.2舒心安神膏对大鼠自主活动的影响观察实验开始前将55只大鼠放入自发活动箱中进行预筛选，观察5 min大鼠自主活动次数，1次/d,连续3 d。以大鼠5 min内总穿格数(30±10)次为标准，剔除不合格大鼠，最终纳入50只大鼠。将大鼠随机分为A、B、C、D、E组，每组10只。A、B、C组分别予0.28、0.84、1.40 g/mL的舒心安神膏1 mL/100 g灌胃[4]，1次/d,连续5 d 。D组于给药第5天予2 mg/kg安定灌胃。E组为空白对照组，予1 mL/100 g纯净水灌胃。末次给药60 min后取各组大鼠置于自发活动箱内，记录5 min内整毛次数、直立次数、中央穿格次数、总穿格次数。

1.3舒心安神膏联合戊巴比妥钠对小鼠睡眠的影响观察采用催眠协同实验[5]。①对阈上剂量戊巴比妥钠的催眠协同作用观察：取健康NIH小鼠50只，分为低、中、高剂量组、安定组、空白组各10只。低、中、高剂量组分别予0.205、0.615、1.025 g/mL的舒心安神膏0.2 mL/10 g灌胃，1次/d,连续5 d。安定组和空白组分别于给药第5天予4 mg/kg安定、0.2 mL/10 g纯净水灌胃。各组均于末次给药60 min时腹腔注射戊巴比妥钠45 mg/kg。观察各组小鼠翻正反射消失和恢复情况，以15 min内翻正反射消失达1 min为入睡指标，并记录入睡时间和苏醒时间，计算各组入睡潜伏期和睡眠时间。入睡潜伏期(min)= 翻正反射消失时间-腹腔注射戊巴比妥钠时间，睡眠持续时间(min)= 苏醒时间-翻正反射消失时间(若动物翻正反射在15 min内未消失，其入睡潜伏期记为15 min，睡眠持续时间记为0)。②对阈下剂量戊巴比妥钠催眠协同作用观察：取健康NIH小鼠50只，分为低、中、高剂量组、安定组、空白组各10只。低、中、高剂量组分别予0.205、0.615、1.025 g/mL的舒心安神膏0.2 mL/10 g灌胃，1次/d,连续5 d。安定组和空白组分别于给药第5天予4 mg/kg安定、0.2 mL/10 g纯净水灌胃。各组均于末次给药60 min时腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg。观察各组入睡个数，计算各组入睡潜伏期和睡眠时间。

1.4舒心安神膏对小鼠肌肉协调运动能力的影响观察采用转棒实验[6]。取健康NIH小鼠60只，实验前在小鼠转棒仪(30 r/min)上训练3次，间隔30 min，3天训练1次，最终筛选出停留时间≥5 min者50只。随机分为1、2、3、4、5组，1、2、3组分别予0.205、0.615、1.025 g/mL 的舒心安神膏0.2 mL/10 g灌胃，1次/d,连续5 d。4、5组分别于给药第5天予4 mg/kg安定、0.2 mL/10 g纯净水灌胃。各组均于末次给药60 min时将各组小鼠置于小鼠转棒仪(30 r/min)观察5 min，记录各组小鼠跌落潜伏期(第一次从转棒上跌落的时间)和5 min内总跌落次数。

2　结果

2.1舒心安神膏对大鼠自主活动的影响各组大鼠自主活动指标比较见表1。

表1　各组大鼠自主活动指标比较(次，±s)

注：与E组比较，*P<0.05。

2.2舒心安神膏协同戊巴比妥钠对小鼠的催眠作用①对阈上剂量戊巴比妥钠的催眠协同作用比较：低、中、高剂量组、安定组、空白组的入睡潜伏期分别为(3.30±0.67)、(2.80±0.79)、(4.30±3.34)、(4.30±1.25)、(4.50±2.17)min，各组间比较差异无统计学意义。低、中、高剂量组、安定组、空白组的睡眠时间分别为(76.00±24.09)、(78.50±25.47)、(80.20±30.70)、(56.60±12.73)、(35.20±13.64)min，低、中、高剂量组和安定组的睡眠时间均长于对照组(P均<0.05)。②对阈下剂量戊巴比妥钠催眠协同作用比较：低、中、高剂量组、安定组、空白组的入睡个数分别为5、6、7、10、0。低、中、高剂量组、安定组、空白组的入睡潜伏期分别为(3.89±3.02)、(3.20±4.32)、(2.80±2.14)、(5.30±2.75)、(15±0)min,各组间比较差异无统计学意义。低、中、高剂量组、安定组、空白组的睡眠时间分别为(36.00±4.53)、(38.00±5.90)、(40.29±7.36)、(36.30±10.32)、0 min,低、中、高剂量组和安定组的睡眠时间均长于对照组(P均<0.05)。

2.3舒心安神膏对小鼠肌肉协调运动能力的影响1、2、3、4、5组的跌落潜伏期分别为(96.30±23.97)、(91.50±14.10)、(97.00±22.19)、(58.20±19.53)、(92.50±15.69)s,4组跌落潜伏期少于5组(P<0.01)。1、2、3、4、5组的5 min内的跌落次数分别为(2.60±1.78)、(2.90±1.37)、(2.30±1.57)、(4.30±1.64)、(2.20±1.32)次,4组跌落次数明显高于其余各组(P均<0.05)。

3　讨论

失眠在中医中称为不寐，首见于《内经》，可称为“目不瞑”、“不得眠”、“不得卧”。《灵枢·大惑论》指出：“卫气不得入于阴，常留于阳，留于阳则阳气满，阳气满则阳跷盛，不得入于阴则阴气虚，故目不瞑矣。”指出人的睡眠与阳气(卫阳)正常出入有关，人体的阳气完全入于阴气中则出现睡眠，完全出于阴气外则觉醒。《素问·阴阳应象大论》所谓“阴在内，阳之守也，阳在外,阴之使也。阳虚卫外功能下降，镇摄无权，心神浮越而失眠”。舒心安神膏可调和阴阳，温阳化气，潜藏安神，膏中熟附子、干姜、甘草温补元阳，乌梅、山萸肉、酸枣仁酸甘化阴，养心安神，桂枝、白芍、大枣、砂仁、白术等调营和卫，运化中焦，全方升降有序，阳升阴降，引导寤寐周期和合，睡眠有律。在临床治疗失眠中显示良好的疗效，前期基础方剂治疗失眠中疗效观察研究中，发现临床疗效可达到70%，可有效改善患者睡眠质量和生存质量[7]。有报道表明熟附子、干姜和甘草温补肾阳，对慢性阳虚失眠症状有明显改善[8，9]，桂枝汤加减(桂枝、白芍、大枣等)可明显改善睡眠质量，降低匹兹堡睡眠质量评分[10，11]，单用酸枣仁可有效改善老年患者睡眠障碍，且与苯二氮卓类药物相比短期疗效相当[12]。因此全方配伍合理，对于慢性阳虚失眠患者更为适宜。

本研究中舒心安神膏可降低大鼠自主活动中直立次数和中央穿格数，表明舒心安神膏能抑制大鼠自主活动。在协同戊巴比妥钠对小鼠的催眠实验中，舒心安神安神膏可增加小鼠的睡眠时间，有协同戊巴比妥钠促进动物睡眠的作用，同时对正常小鼠的肌平衡能力无明显影响，未出现类似安定组的肌松和丧失运动平衡能力作用。有文献报道乌梅水煎液对小鼠有镇静催眠及抗惊厥作用[13]，酸枣仁汤可延长慢波睡眠，提高睡眠质量[14]。故此舒心安神膏的镇静催眠作用有可能是在动物体内多靶点、多系统综合调节作用。

失眠是一个主动的神经调节过程，与神经系统内某些特定的结构和神经递质的作用密切相关，神经递质通过调节睡眠和觉醒来抑制或促进睡眠[15]。γ-氨基丁酸(GABA)是脑组织中抑制性氨基酸类物质，可抑制神经元兴奋促进睡眠[16]，脑干中的5-HT也具有抑制兴奋作用，有利于维持慢波睡眠，去甲肾上腺素在中枢的作用一般以兴奋为主，促进觉醒系统[15]。对于失眠治疗多采用氨基丁酸A复合体激动药(GABAA)、褪黑素受体激动药、抗抑郁药、抗组胺药等，这些药物通过延长总睡眠时间和快动眼睡眠、或缩短睡眠潜伏期，或抗焦虑抗抑郁来催眠镇静，改变了睡眠结构时间分布，长期应用可引起日间困倦、成瘾性和戒断症状和精神运动损害[17,18]。舒心安神膏在临床治疗中未发现有日间功能受影响作用，且在前期模式生物研究中发现，舒心安神膏对斑马鱼光照和黑暗条件下运动行为学影响不同[3],不是完全抑制动物活性，有双相调节可能。方中四逆汤有改善血循环和神经功能[19],桂枝汤对下丘脑5-HT起到双相调节作用[20]，酸枣仁总皂苷能够调节失眠老年大鼠谷氨酸(Glu)/GABA两种氨基酸类神经递质含量及比值来降低脑内神经兴奋性[21]。

综上所述，舒心安神膏能抑制大鼠自主活动，可协同戊巴比妥钠促进小鼠睡眠，且对小鼠运动协调能力影响较小。但其具体作用机制尚有待进一步深入研究。

[1] 赵忠新,潘集阳,季建林.失眠定义、诊断及药物治疗专家共识[J].中华神经科杂志，2006,39(2):141-142.

[2] 徐福平,黄鹂,原嘉民,等.舒心安神膏对睡眠剥夺大鼠脑组织中单胺类神经递质含量的影响[J].广东医学,2015,36(6):828-831.

[3] 徐福平,蔡庆豪,裴中,等.舒心安神膏对斑马鱼运动行为的影响[J].中华中医药杂志，2015,30(12):4485-4488.

[4] 黄继汉,黄晓晖,陈志扬,等.药理实验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算[J].中药临床药理学与治疗学,2004,9(9):1069-1072.

[5] 魏伟,吴希美,李元建.药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社,2010:639.

[6] 钟琳,王晓舜,王婷婷,等.青娥方提取物对D-半乳糖致衰老小鼠的延缓衰老作用及机制[J].中国实验方剂学杂志,2015,21(16):134-138.

[7] 黄春华,周雯,杨小波,等.温阳法治疗阳虚型失眠症疗效观察及生存质量研究[J].新中医,2013,45(9):29-31.

[8] 黄春华,陈建斌,黄鹂,等.从阳虚论治失眠中医文献评析[J].中医杂志,2012,53(16):1412-1415.

[9] 杜磊,张蓉,杨云霜,等.温阳安神法治疗阳虚失眠的理论探讨[J].湖北中医杂志,2014,36(6):54-55.

[10] 李希民,李欢,侯江红.调和营卫法治疗亚健康失眠的疗效观察[J].中国中医基础医学杂志,2014,20(2):264-265.

[11] 邱存全,曹吉宪.运用桂枝汤调和阴阳辨治失眠症临床体会[J].新中医,2010,42(3):89-90.

[12] 杨玉玲,王雪婷,田玉双,等.酸枣仁治疗老年失眠症疗效观察[J].现代中西医结合杂志,2012,21(3):258-259.

[13] 黎同明,高洁,王桂香.乌梅水煎液镇静催眠及抗惊厥作用实验研究[J].中医学报,2011,26(7):818-820.

[14] 金阳,李飞,李廷利.酸枣仁汤对失眠大鼠睡眠时相的影响[J].时珍国医国药,2008,19(6):1355-1356.

[15] 赵忠新,黄继忠,王晔,等.临床睡眠障碍学[M].上海:第二军医大学出版社,2003:39-41.

[16] 刘晶,李峰,宋月晗.GABA能系统与失眠[J].现代生物医学进展,2012,12(18):3589-3591.

[17] Pinto LR Jr,Bittencourt LR,Treptow EC,et al.Eszopiclone versus zopiclone in the treatment of insomnia[J].Clinics(Sao Paulo),2016,71(1):5-9.

[18] Nakamura M,Inoue Y.Benzodiazepine and nonbenzodiazepine hypnotics[J].Nihon Rinsho,2015,73(6): 1010-1015.

[19] 杨学伟,崇卓,郭云良.四逆汤作用机制的研究[J].国际中医中药杂志,2006,28(1):33-36.

[20] 富杭育,周爱香,郭淑英,等.桂枝汤对体温双向调节作用机理探讨-对下丘脑5-羟色胺的影响[J].中药药理与临床,1995,12(2):1-4.

[21]张舜波,王平,田代志,等.酸枣仁总皂苷对失眠老年大鼠脑氨基酸类神经递质及受体表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(4):124-127.

Effect of Shuxin Anshen paste on rat′s autonomic activity and the effect of Shuxin Anshen paste and sodium pentobarbital on mouse′s sleep and motor coordination

XU Fuping1,LIANG Haoyue,LIN Liyu,YANG Zhimin

(1 Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine,Guangzhou 510120,China)

ObjectiveTo observe the effect of Shuxin Anshen paste on rat′sautonomic activities by intragastric administration and the effect of Shuxin Anshen paste combined with sodium pentobarbital on mouse′s sleep and motor coordination by intraperitoneal injection.MethodsFifty SPF SD rats were randomly divided into groups A,B,C,D and E,each group had 10 rats.Groups A,B,C were separately given 1 mL/100 g Shuxin Anshen paste at the concentration of 0.28 g/mL,0.84 g/mL and 1.40 g/mL by intragastric administration once a day for 5 days.Group D was given 1 mL/100 g diazepam by intragastric administration on the 5th day.Group E was given 1 mL/100 g pure water as the control group.Sixty minutes after the last drug administration,all rats were put in the spontaneous activity box.The times of standing,grooming,central grilling and total crossing in 5 minutes were recorded.Fifty NIH mice were randomly assigned into low dosage group,medium dosage group,high dosage group,diazepam group and blank group,each group had 10 mice.Low dosage group,medium dosage group and high dosage group were separately given 0.2 mL/10 g Shuxin Anshen paste at the concentration of 0.205,0.615 and 1.025 g/mL by intragastric administration once a day for 5 days.Diazepam group and control group were separately given 4 mg/kg diazepam and 1 mL/100 g pure water by intragastric administration on the 5th day.Sixty minutes after the last drug administration,each group was separately given pentobarbital sodium 45(the up threshold dose)and 40(the under threshold dose)mg/kg by intraperitoneal injection.All groups′ sleep latency and sleep time was measured and recorded.Fifty NIH mice were randomly assigned into groups 1,2,3,4 and 5.Groups 1,2 and 3 were given 0.2 mL/10 g Shuxin Anshen paste at the concentration of 0.205,0.615 and 1.025 g/mL by intragastric administration once a day for 5 day.Groups 4 and 5 were separately given 4 mg/kg diazepam and 0.2 mL/10 g pure water by intragastric administration on the 5th day.Sixty minutes after the last drug administration,each group was put on the rolling-bar device and was observed for 5 minutes.Falling latency and total falling times in 5 minutes were recorded.ResultsIn the autonomic activity test,the times of standing and the central grilling of groups A,B,C and D were significantly less than that of group E(all P<0.05).In the sedative and hypnotic experiment using Shuxin Anshen paste and pentobarbital sodium(the up threshold dose),the sleep latency among low dosage group,medium dosage group,high dosage group,diazepam group and control group was not statistically significant,but the sleep time of these group was significantly higher than that of the control group(all P<0.05).In the experiment of promoting the hypnosis in mice by Shuxin Anshen paste and pentobarbital sodium with the under threshold dose,the sleep latency of low dosage group,medium dosage group,high dosage group,diazepam group and control group was(3.89±3.02),(3.20±4.32),(2.80±2.14),(5.30±2.75)and(15±0)min.The sleep time of these groups was(36.00±4.53),(38.00±5.90),(40.29±7.36),(36.30±10.32)and 0 min.The falling latency of group 4 was significantly less than that of the other groups,and the falling time in 5 minutes of group 4 was significantly higher than that of the other groups(all P<0.05).ConclusionsShuxin Anshen paste can suppress the rat′s autonomic activity.The synergism of Shuxin Anshen paste and pentobarbital sodium can promote the mouse′s sleep and have little influence on the muscle coordination.

Shuxin Anshen paste;rats;mice;sedation;hypnosis;muscle coordination

国家自然科学基金青年基金资助项目(81503515)；广东省自然科学基金资助项目(2015A030310255)；广东省科技厅计划项目(2014A020221088)。

徐福平(1983-)，男，博士，主治医师，主要研究方向为中医脑病学，E-mail：xufuping163@163.com

简介：杨志敏(1966-)，女，主任医师，教授，主要研究方向为中医脑病学。E-mail：315956521@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.004

R256

A

1002-266X(2016)27-0012-04

2016-03-26)