5-Aza-dC、TSA腹腔注射治疗小鼠子宫内膜异位症疗效观察

沈芳华，吕弘道，高红，徐彩英，王利明，顾莲萍

(1南通大学附属吴江医院，江苏苏州215200；2苏州市吴江区第一人民医院)



5-Aza-dC、TSA腹腔注射治疗小鼠子宫内膜异位症疗效观察

沈芳华1，2，吕弘道1，2，高红1，2，徐彩英1，2，王利明1，2，顾莲萍1，2

(1南通大学附属吴江医院，江苏苏州215200；2苏州市吴江区第一人民医院)

目的观察5′-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-dC)、曲古抑菌素A(TSA)腹腔注射治疗小鼠子宫内膜异位症(内异症)的疗效。方法取35只BALB/c小鼠，将子宫片段分别缝于双侧腹膜、双角子宫起始处及肠系膜处制作内异症模型。建模3周后分为4组，5-Aza-dC组腹腔注射5-Aza-dC 0.5 mg/(kg·d)，TSA组腹腔注射TSA 0.5 mg/(kg·d)，达那唑组给予达那唑110 mg/(kg·d)灌胃，模型对照组腹腔注射等量生理盐水。分别于给药前及给药3周测算各组异位内膜病灶体积。8只小鼠正常饲养，设为正常对照组，采用醋酸扭体实验评估各组小鼠给药1、3周时的疼痛反应。结果5-Aza-dC组、TSA组及达那唑组给药3周时异位内膜病灶体积较给药前明显缩小(P均<0.01)。模型对照组与正常对照组相比，疼痛反应时间缩短、扭体次数增加(P均<0.01)；5-Aza-dC组、TSA组组内不同给药时间的疼痛反应时间、扭体次数相比，P均<0.05；5-Aza-dC组、TSA组疼痛反应时间较模型对照组延长、扭体次数减少(P均<0.05)。结论5-Aza-dC、TSA治疗小鼠内异症有效，可减小异位病灶体积，同时减轻疼痛。

子宫内膜异位症；5′-氮杂-2′-脱氧胞苷；曲古抑菌素A；动物实验

子宫内膜异位症(以下简称内异症)是一种妇科常见病，至今尚无根治药物。多项研究[1，2]发现，内异症可能是一种表观遗传学疾病。DNA甲基化及组蛋白去乙酰化是表观遗传学改变的重要表现方式，这些过程可逆。5′-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-dC)是一种嘧啶类去甲基化药物。曲古抑菌素A(TSA)是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂。有学者[3～6]通过体外细胞实验发现，5-Aza-dC、TSA可通过多种机制抑制异位内膜细胞增殖并诱导其凋亡。2014年10月～2015年2月，我们制作了小鼠内异症模型，观察了5-Aza-dC、TSA治疗内异症的效果，现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物与材料健康、雌性、未孕、6～8周龄BALB/c小鼠45只(上海动物实验研究所提供)，体质量20～24.2 g，饲以高压灭菌饲料及无菌水，实验前在饲养室饲养2周以适应环境。5-Aza-dC，TSA，苯甲酸雌二醇，达那唑，戊巴比妥钠，青霉素，冰醋酸，相差显微镜(型号Olympus CKX41)。

1.2内异症小鼠模型制作取35只BALB/c小鼠，戊巴比妥钠80 mg/kg腹腔注射麻醉，将小鼠左侧子宫卵巢端及阴道端两侧结扎，剪下左侧子宫，纵剖及横断成4个片段，分别缝于双侧腹膜、双角子宫起始的“V”形处及肠系膜处。术后1～3 d肌注青霉素170万U/(kg·d)，分别于术后第2、5、8、11天肌注苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg促进异位内膜生长。建模第3周末，剖腹探查异位内膜生长情况，以移植物体积增大呈透明结节状或囊状、内有液体集聚、表面有结缔组织覆盖及血管形成视为建模成功。取部分组织做病理检查证实。

1.3动物分组与5-Aza-dC、TSA用法将建模成功的32只小鼠随机分为4组，每组8只。5-Aza-dC组腹腔注射5-Aza-dC 0.5 mg/(kg·d)[7]；TSA组腹腔注射TSA 0.5 mg/(kg·d)；达那唑组以达那唑110 mg/(kg·d)灌胃；模型对照组腹腔注射等量生理盐水。

1.4异位病灶体积测算分别于给药前及给药3周时测量各组小鼠异位内膜病灶的长、宽、高并以长×宽×高计算病灶体积，每只小鼠取四个病灶的均值。同时收集异位内膜组织，室温固定24 h，脱水后石蜡包埋，做5 μm厚切片，进行HE染色，显微镜下观察病理变化。

1.5小鼠疼痛反应观察分别于给药1、3周时进行醋酸扭体实验。各组小鼠腹腔注射0.6%醋酸0.2 mL/只，用秒表记录小鼠出现疼痛反应时间及20 min内的扭体次数。另取正常饲养的8只小鼠设为正常对照组，与各建模组同时进行醋酸扭体实验。

2　结果

2.1各组小鼠给药前后异位病灶体积比较5-Aza-dC组给药前及给药3周时异位病灶体积分别为(69.25±25.19)、(13.91±16.09)mm3，TSA组分别为(60.19±22.38)、(14.20±19.44)mm3，达那唑组分别为(68.25±13.13)、(24.06±9.28)mm3，模型对照组分别为(68.63±16.53)、(67.13±26.56)mm3。5-Aza-dC组、TSA组及达那唑组给药前后异位病灶体积相比，P均<0.01；5-Aza-dC组、TSA组及达那唑组给药3周时异位病灶体积相比，P均>0.05。

2.2各组小鼠疼痛反应比较模型对照组与正常对照组相比，疼痛反应时间缩短，扭体次数增加(P均<0.01)；5-Aza-dC组、TSA组组内不同给药时间的疼痛反应时间、扭体次数相比，P均<0.05；5-Aza-dC组、TSA组疼痛反应时间较模型对照组延长、扭体次数减少(P均<0.05)。见表1。

表1　各组小鼠疼痛反应时间及扭体次数比较±s)

注：与同组给药1周时相比，*P<0.05；与正常对照组相比，#P<0.01；与模型对照组相比，△P<0.05。

3　讨论

内异症的现有药物治疗方案如孕激素、雄激素及促性腺激素释放激素激动剂等均只能暂时缓解症状，无法达到根治，手术治疗后复发率也很高，所以，新的治疗方式正在不断探索中。越来越多的研究发现，表观遗传学改变在内异症的发生发展中起重要作用。表观遗传学改变主要表现为DNA甲基化修饰和组蛋白的去乙酰化修饰等[8，9]。有学者[2，10]发现，内异症患者的许多基因均存在表观遗传学改变，此过程可逆，如采用甲基转移酶抑制剂或去乙酰化酶抑制剂，有望从基因水平逆转疾病进展，进行基因靶向治疗[11]。

5-Aza-dC是一种嘧啶类去甲基化药物。TSA为组蛋白去乙酰化酶抑制剂。研究[12]发现，5-Aza-dC在体外可通过不同途径抑制多种肿瘤细胞增殖，而且，5-Aza-dC在复发性、顽固性白血病和慢性髓性白血病危象治疗方面已进入Ⅲ期临床试验。TSA也可抑制多种肿瘤细胞生长，如白血病细胞、肝癌细胞、胃癌细胞等[13]。体外实验中已发现5-Aza-dC 、TSA可明显抑制异位内膜生长[3～6，14]，这为内异症的治疗提供了一条全新途径。有学者[15]发现TSA可抑制小鼠异位病灶生长，下调异位病灶中痛觉相关基因瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)的表达。本实验建立了小鼠内异症模型，并给予5-Aza-dC、TSA、达那唑，发现5-Aza-dC组、TSA组、达那唑组内异症病灶体积较模型对照组明显缩小，可见5-Aza-dC及TSA治疗内异症有一定效果。

内异症是一种疼痛相关疾病，该病最主要的临床表现为疼痛，包括痛经、慢性盆腔痛、性交痛等。有学者[16]发现内异症患者痛阈较正常人群降低。小鼠醋酸扭体实验是常用的镇痛药筛选方法。我们通过醋酸扭体实验发现，模型对照组与正常对照组相比，疼痛反应时间有所缩短、扭体次数增加，提示内异症小鼠痛阈较正常小鼠有所降低，这与He等[16]的研究结论一致。5-Aza-dC组及TSA组与模型对照组相比，疼痛反应时间延长、扭体次数减少，表明5-Aza-dC、TSA有一定的镇痛作用。

总之，我们认为，5-Aza-dC、TSA治疗小鼠内异症有效，可减小异位病灶体积，同时减轻疼痛，5-Aza-dC、TSA有望成为治疗内异症新的药物，但两药的具体作用机制和不良反应仍需进一步研究。

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2015-10-10)