宫颈癌组织中KGF、KGFR及MMP-9的表达变化

李争，陈瑜，王振国

(1河北北方学院，河北张家口075000；2中国人民解放军第三○九医院)



宫颈癌组织中KGF、KGFR及MMP-9的表达变化

李争1，陈瑜1，王振国2

(1河北北方学院，河北张家口075000；2中国人民解放军第三○九医院)

目的观察宫颈癌组织中角化生长因子(KGF)、KGF受体(KGFR)与基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达变化，并探讨其意义。方法采用免疫组化法检测56例宫颈癌组织(宫颈癌组)及21例正常宫颈组织(对照组)中的KGF、KGFR、MMP-9，分析三者与宫颈癌临床病理参数的关系及三者表达的相关性。结果宫颈癌组KGF、KGFR、MMP-9表达阳性分别为40、26、44例，对照组分别为4、2、4例，宫颈癌组KGF、KGFR、MMP-9阳性表达例数与对照组相比，P均<0.05。有脉管转移的宫颈癌组织中KGF、KGFR、KGF/KGFR、MMP-9阳性表达例数高于无脉管转移者(P均<0.05)；有淋巴结转移者KGFR、KGF/KGFR、MMP-9阳性表达例数高于无淋巴结转移者(P均<0.05)；低分化者MMP-9阳性表达例数高于中、高分化者(P<0.05)。宫颈癌组织中KGF表达与KGFR、MMP-9表达均呈正相关关系(r分别为0.272、0.440，P均<0.05)。结论宫颈癌组织中KGF、KGFR、MMP-9表达增高，三者的异常表达与宫颈癌的发生发展有关，三者之间可能存在协同作用。

宫颈癌；角化生长因子；角化生长因子受体；基质金属蛋白酶9

我国宫颈癌发病率为5.54%，在所有女性肿瘤中发病率居第四[1]。目前认为宫颈癌是一种感染性疾病，主要由高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染所致，但并非所有感染HPV的患者都会发生宫颈癌。所以宫颈癌发病可能是多因素共同作用的结果。角化生长因子(KGF)、KGF受体(KGFR)在上皮性肿瘤的发生发展中起重要作用，目前已发现二者在多种肿瘤组织中异常表达[2]。KGFR在宫颈癌细胞系Hela、CaSki及宫颈癌组织中亦呈高表达[3,4]，推测其表达可能与宫颈癌的发生发展有关。KGF主要作用于上皮细胞，具有促进上皮细胞有丝分裂、生长、分化、迁移等生物活性[5]，KGF可通过激活NF-κB从而诱导血管内皮生长因子A、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和尿激酶型纤维酶原激活物表达[6]。MMP-9被证实与肿瘤侵袭及转移有关。我们观察了宫颈癌组织中KGF、KGFR与MMP-9的表达变化，并探讨三者与宫颈癌发生发展的关系。

1　材料与方法

1.1组织标本2011年8月～2015年12月中国人民解放军第309医院手术切除的宫颈癌组织标本56例份(均为宫颈鳞癌，宫颈癌组)、正常宫颈组织标本21例份(对照组)。所有标本均来源于行宫颈癌根治术的宫颈癌患者。患者年龄25～65岁，FIGO分期ⅠA期7例、ⅠB期29例、ⅡA期15例、ⅡB期4例、Ⅲ期1例，组织病理学分级为高分化6例、中分化20例、低分化30例，术前未接受过放化疗及靶向治疗。

1.2主要试剂兔抗人KGF及KGFR多克隆抗体购自武汉博士德生物有限公司，鼠抗人MMP-9单克隆抗体、山羊血清封闭液和免疫组化试剂盒PV6000(一步法聚合物检测系统)购自北京中杉生物技术公司。

1.3KGF、KGFR、MMP-9检测方法采用免疫组化染色(即用型一步法)：石蜡包埋组织切片，常规脱蜡水化，高压修复抗原(KGF、KGFR选用柠檬酸缓冲液，MMP-9选用EDTA)，经内源性过氧化酶(3% H2O2)阻断剂孵育10 min，PBS缓冲液冲洗。5%山羊血清37 ℃封闭15 min，滤纸吸净液体后加KGF/KGFR兔抗人多克隆抗体、MMP-9鼠抗人单克隆抗体(稀释度1∶50)，4 ℃冰箱过夜。PBS缓冲液冲洗后加入即用型二抗，37 ℃孵育30 min，PBS缓冲液冲洗，常规DAB显色，苏木素复染、脱水、透明，封片镜检。相同石蜡切片以PBS替代一抗作为阴性对照，用已知阳性片作阳性对照。采用双盲法由两位病理科主任医师分别阅片。蛋白表达定位于细胞质和(或)细胞膜。参照文献[7]方法，以染色强度和阳性细胞百分比判定结果，染色强度为无色计0分、淡黄色计1分、棕黄色计2分、棕褐色计3分，阳性细胞百分比为0%计0分、≤10%计1分、>10%～50%计2分、>50%～75%计3分、>75%计4分，两项得分相乘，>3判定为目的蛋白表达阳性。

1.4统计学方法采用SPSS20.0软件进行统计分析。计数资料采用χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析法。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1宫颈癌组与对照组KGF、KGFR、MMP-9表达比较宫颈癌组KGF、KGFR、MMP-9表达阳性分别为40、26、44例，对照组分别为4、2、4例，宫颈癌组KGF、KGFR、MMP-9阳性表达例数与对照组相比，P均<0.05。见图1～3。

注：A为宫颈癌组，B为对照组。

图1两组KGF表达情况

注：A为宫颈癌组，B为对照组。

图2两组KGFR表达情况

注：A为宫颈癌组，B为对照组。

图3两组MMP-9表达情况

2.2KGF、KGFR、MMP-9表达与宫颈癌临床病理参数的关系有脉管转移的宫颈癌组织中KGF、KGFR、KGF/KGFR、MMP-9阳性表达例数高于无脉管转移者(P均<0.05)；有淋巴结转移者KGFR、KGF/KGFR、MMP-9阳性表达例数高于无淋巴结转移者(P均<0.05)；低分化者MMP-9阳性表达例数高于中、高分化者(P<0.05)。详见表1。

表1　KGF、KGFR、MMP-9表达与宫颈癌临床病理参数的关系(例)

注：与有淋巴结转移者相比，#P<0.05；与有脉管转移者相比，*P均<0.05；与低分化者相比，ΔP均<0.05。

2.3宫颈癌组织中KGF、KGFR、MMP-9表达的相关性KGF表达阳性的40例宫颈癌组织中，KGFR阳性22例、MMP-9阳性36例，Spearman等级相关分析结果显示，KGF表达与KGFR、MMP-9表达均呈正相关关系(r分别为0.272、0.440，P均<0.05)。

3　讨论

KGF是成纤维细胞生长因子家族成员之一，由Robin等[8]从胚胎肺成纤维细胞培养液上清中分离纯化得到。KGF主要由各种来源的间质细胞及T淋巴细胞产生，作用于上皮细胞，具有促进上皮细胞增殖、分化、迁移等活性[9]。KGFR主要表达于上皮细胞，可被KGF特异性识别[10]，同时也可识别FGF-1、3、10，但KGF与KGFR之间的连接更具高效性，二者共同调节细胞的生理活动。早期研究[3,4,11,12]发现KGF、KGFR在宫颈癌细胞系Hela、CaSki及宫颈癌组织中有异常高表达，推测其表达可能与宫颈癌的发生发展有关。本研究中，宫颈癌组KGF、KGFR阳性表达例数高于对照组，且在有脉管转移者和淋巴结转移的宫颈癌组织中阳性表达例数更多，提示KGF、KGFR参与宫颈癌的发病，二者高表达与宫颈癌侵袭、转移有关，与相关研究结果一致。

MMP-9为MMP家族成员之一，主要参与基底膜及细胞外基质Ⅳ胶原的水解，从而使肿瘤细胞突破组织屏障，对周围正常组织进行侵袭并发生远处转移[13,14]。早期研究[15]表明，MMP-9表达随宫颈病变严重程度增高而增高，可能是宫颈损伤的一种标志物。本研究中，宫颈癌组MMP-9阳性表达例数高于对照组，且在有淋巴结转移、脉管转移者的宫颈癌组织中表达更高，推测MMP-9高表达参与了宫颈癌的发病和进展，可能成为宫颈癌侵袭转移能力的参考指标。

KGF仅能与KGFR相连接而发挥作用，因此抑制KGFR即可使KGF的生理活性受到抑制，二者在肿瘤发生发展中起协同作用。本研究结果显示，宫颈癌组织中KGF与KGFR表达呈正相关关系，二者联合表达在有脉管转移的肿瘤组织中更为常见，证实了上述观点。同时，宫颈癌组织中KGF表达与MMP-9表达也呈正相关关系，提示KGF、MMP-9协同参与宫颈癌的发病和侵袭，但二者协同致病的具体机制尚不明确，推测二者间可能存在一定的信号转导通路，KGF可诱导MMP-9表达，促进肿瘤侵袭转移[16～18]。

总之，宫颈癌的发生发展是多阶段、多步骤的，KGF、KGFR、MMP-9异常表达参与了宫颈癌的发病和侵袭过程，三者之间存在一定相互作用。KGF、KGFR及MMP-9有望成为宫颈癌诊断及预后评估的标志物，甚至可能成为宫颈癌靶向治疗的新的靶点。

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王振国(E-mail: guozheng1963@163.com)

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B

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2016-02-22)