体外培养的人恶性黑色素瘤球体细胞干细胞特性观察

文辉才，眭云鹏，简雪平，廖怀伟，马丽，徐桂珍，刘燕平，万珺

(南昌大学第一附属医院，南昌330006)



体外培养的人恶性黑色素瘤球体细胞干细胞特性观察

文辉才，眭云鹏，简雪平，廖怀伟，马丽，徐桂珍，刘燕平，万珺

(南昌大学第一附属医院，南昌330006)

目的观察体外培养的人恶性黑色素瘤球体细胞的干细胞特性。方法利用无血清培养基培养人恶性黑色素瘤A375细胞系，获得黑色素瘤球体细胞(球体组)和普通贴壁细胞(贴壁组)。采用Transwell小室检测两组细胞迁移能力。采用免疫荧光法检测两组细胞中的CD20、CD133。取BALB/c小鼠16只，分实验组和对照组(各8只)，于小鼠肩胛骨处皮下分别注射球体组、贴壁组细胞各1 mL(104个细胞)，观察并比较两组细胞致瘤能力。6周后处死小鼠，取瘤。结果A375细胞接种于无血清培养基后，可见小的类圆形悬浮细胞球形成并逐渐变大，球内细胞连接紧密，折光性好。球体组细胞迁移能力及细胞中CD20、CD133表达强度均高于贴壁组。注射细胞6周后，实验组小鼠均长出较大肿瘤，对照组小鼠均未见肿瘤生长。取实验组小鼠的肿瘤组织行HE染色，病理诊断为恶性黑色素瘤。结论体外培养的人恶性黑色素瘤球体细胞具有干细胞特性，迁移能力和致瘤能力强，高表达免疫标记CD20、CD133，恶性黑色素瘤存在肿瘤干细胞。

黑色素瘤；肿瘤干细胞；无血清培养基

恶性黑色素瘤是起源于皮肤黑色素细胞的高度恶性肿瘤[1]，其恶性程度高、易复发、进展快，手术、放疗、化疗等传统治疗方法疗效均较差[2,3]，需要寻找新的治疗手段[4]。新近研究[5]发现，黑色素瘤细胞体外培养可形成球体细胞，球体细胞形成实验可富集干细胞。2014年9月～2015年4月，我们以无血清培养基(SFM，由DMEM/F12、10 ng/mL bFGF、B27、20 ng/mL EGF组成)培养恶性黑色素瘤A375细胞系，分离、扩增出黑色素瘤球体细胞并观察其干细胞特性，现报告如下。

1　材料与方法

1.1主要实验材料人恶性黑色素瘤A375细胞系购自上海中国科学院细胞库。BALB/c小鼠均为雌性，体质量18～20 g，4～6周龄，饲养于SPF级环境中。DMEM/F12(1∶1)细胞培养液，优级胎牛血清，0.25%胰酶消化液，B27，碱性成纤维细胞因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)，超低吸附培养板，超净工作台，CO2培养箱。

1.2恶性黑色素瘤球体细胞的获取与培养A375细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)细胞培养液在37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，当细胞融合达80%时，胰蛋白酶消化细胞，1∶2传代。取贴壁培养的对数生长期A375细胞用PBS液清洗，胰酶消化，经台盼蓝染色并计数后重悬于SFM中，以1×104/mL接种于6孔超低吸附培养板，放入37 ℃、5% CO2、95%湿度的培养箱中培养。每隔1 d在每孔加入0.5 mL新鲜SFM。培养2周可形成球体细胞，球体细胞形成3～4 d后，收集细胞并机械吹打成单细胞悬液，重悬于SFM，按1∶3比例传代培养，倒置显微镜下观察细胞形态变化。将球体细胞纳入球体组，贴壁细胞纳入贴壁组。

1.3恶性黑色素瘤细胞迁移能力检测将含10%血清的DMEM/F12培养基按600 μL/孔加入到24孔板中，取出Transwell小室放入24孔板中，将贴壁组和球体组细胞在无血清DMEM/F12培养基重悬后加入未铺胶的小室上层，置入37 ℃孵箱培养12 h，4%多聚甲醛固定20 min，结晶紫染色，用棉签拭去小室上层细胞，清洗后置于显微镜下观察。

1.4恶性黑色素瘤细胞免疫表型检测分别将贴壁组和球体组细胞种植于盖玻片上培养，等细胞爬满盖玻片后用4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，用0.3% Triton X-100室温下穿孔，PBS洗3次，3% BSA室温下封闭，加入荧光素标记的鼠抗人CD133、CD20抗体，DAPI染色，抗淬灭封片剂封片，在激光共聚焦显微镜下观察、照相。

1.5恶性黑色素瘤细胞成瘤实验取BALB/c小鼠16只，分实验组和对照组，每组8只。在实验组和对照组小鼠肩胛骨处皮下分别注射球体组、贴壁组细胞各1 mL(104个细胞)。观察并比较两组细胞致瘤能力。6周后处死小鼠，取瘤。

2　结果

A375细胞接种于无血清培养基后2～3 d，大部分细胞死亡崩解，少数细胞存活，悬浮生长，细胞逐渐变大，呈卵圆形或圆形，折光性好，一周后可见小的类圆形悬浮细胞球形成并逐渐变大，球内细胞连接紧密，无法区分细胞间界限，折光性好，新生的单个细胞常以“出芽”方式连接在球体表面。2周时细胞球体积达到最大。见图1。

图1　无血清悬浮培养黑色素瘤球体细胞(200×)

2.1球体细胞迁移能力球体组迁移细胞数目为(158.3±5.0)个/视野、贴壁组为(75.3±4.4)个/视野，两组相比，P<0.05。

2.2球体细胞CD20、CD133表达情况球体组与贴壁组细胞中均检测到CD20、CD133，且球体组细胞CD20、CD133表达强度高于贴壁组细胞。见图2、3。

2.3球体细胞致瘤能力实验组小鼠注射球体组细胞后2周看到有肿瘤凸起皮面，对照组小鼠未见肿瘤形成。注射细胞6周后，实验组小鼠均长出较大肿瘤，对照组小鼠均未见肿瘤生长(见图4)。取实验组肿瘤组织，病理诊断为恶性黑色素瘤。

注：A为球体组细胞，B为贴壁组细胞。

图2球体组与贴壁组细胞中CD20表达情况

注：A为球体组细胞，B为贴壁组细胞。

图3球体组与贴壁组细胞中CD133表达情况

注：A为实验组，B为对照组。

图4实验组与对照组小鼠注入细胞6周后瘤体形成情况

3　讨论

肿瘤干细胞具有很强的分化潜能和自我更新能力，具有耐药性，是肿瘤增殖、转移、复发的重要原因[6，7]。Fang等[8]用人胚胎干细胞的培养基培养原代恶性黑色素瘤细胞，发现约20%的恶性黑色素瘤细胞能形成悬浮肿瘤球，这些悬浮球体细胞具有可塑性[9]，能在适当培养条件下分化成多种类型的细胞，如骨细胞[10]、软骨细胞[11]、脂肪细胞[12]等。Mansur等[13]从恶性黑色素瘤中分离出表达CD133的细胞亚群，并发现所有的CD133阳性细胞均可在NOD/SCID小鼠体内成瘤，而CD133阴性细胞则不能成瘤。上述研究成果提供了恶性黑色素瘤干细胞存在的直接证据。

肿瘤干细胞研究的首要工作是分离出肿瘤干细胞[14]。最新研究[15]证实，含EGF和bFGF的SFM可分离出各种实体瘤的肿瘤干细胞。我们利用含EGF、bFGF和B27添加剂的SFM分离人恶性黑色素瘤A375细胞系的肿瘤干细胞，结果显示，A375细胞在SFM中能够形成球体细胞，延长培养时间，球体细胞数量可增多、体积增大，证实无血清环境能刺激肿瘤干细胞分裂增殖。

肿瘤细胞迁移性越强，转移能力也就越强[16]。我们通过Transwell小室检测球体组与贴壁组细胞的迁移能力，结果显示球体组细胞迁移能力明显强于贴壁组。CD20是B细胞表面常见的标志物，CD20阳性的黑色素瘤细胞具备肿瘤干细胞的特征。CD133广泛存在于实体瘤干细胞表面，为脑肿瘤、结肠癌、急性粒细胞性白血病的肿瘤起始细胞表面标志物。球体组细胞与贴壁组细胞均可表达CD20、CD133，且球体组细胞表达强度更高，这进一步表明黑色素瘤A375细胞中存在肿瘤干细胞，其迁移能力更强。我们将两种细胞分别注入BALB/c小鼠皮下，发现注射细胞6周后实验组小鼠均成瘤，而对照组小鼠无一成瘤，取实验组小鼠肿瘤组织行HE染色，均证实为恶性黑色素瘤，这提示富集干细胞的球体细胞比普通贴壁细胞具有更强的致瘤能力。我们认为，无血清培养的人恶性黑色素瘤球体细胞具有干细胞特性，迁移能力和致瘤能力强，恶性黑色素瘤存在肿瘤干细胞。这为恶性黑色素瘤的治疗提供了新的研究方向。

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Stem cell characteristics of human malignant melanoma sphere cells cultured in vitro

WEN Huicai,SUI Yunpeng,JIAN Xueping,LIAO Huaiwei,MA Li,XU Guizhen,LIU Yanping,WAN Jun

(The First Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China)

ObjectiveTo observe the stem cell properties of human malignant melanoma cells cultured in serum-free medium.MethodsHuman malignant melanoma A375 cell line was cultured in serum-free medium,and the melanoma sphere cells (sphere group) and common adherent cells (adherent group) were obtained.Cell migration was detected using Transwell chamber.CD20 and CD133 were detected by immunofluorescence.Sixteen BALB/c mice were divided into the experimental group and control group (8 rats in each group),and the sphere cells and the adherent cells of 1 mL (104) were injected into the mouse shoulder blade by subcutaneous injection in the sphere and the adherent groups,respectively.The tumor cells were observed and compared between the two groups.Six weeks later,the mice were killed to obtain the tumor tissues.ResultsA375 cells were seeded in serum-free medium,visible small round ball suspension cells formed and gradually becomes larger,the ball inside the cells were closely connected with good refraction.The cell migration ability and the expression intensity of CD20 and CD133 in the sphere group were higher than those in the adherent group.After 6 weeks of injection,the mice in the experimental group had a large tumor,and no tumor growth was found in the control group.The tumor tissues of the experimental group were stained with HE,and the malignant melanoma was pathologically diagnosed.ConclusionsHuman malignant melanoma cells cultured in serum-free medium have the characteristics of stem cells with high migration ability and tumorigenesis.High expression of immune markers CD20,CD133 is found and malignant melanoma exists in the tumor stem cells.

melanoma; tumor stem cells; serum-free medium

江西省科技支撑计划项目(2010BSA14600)。

文辉才(1973-)，男，医学博士，副主任医师，副教授，硕士生导师，主要研究方向为皮肤体表肿瘤、器官再造，改脸型。E-mail: whcjxmc@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.19.007

R739.5

A

1002-266X(2016)19-0022-03

2015-12-14)