曲古抑菌素A对卵巢癌细胞分化、增殖的影响及其机制

赖文升，史紫君，万晓蕾，薛晶，邵根宝，邹圣强

(1江苏大学医学院，江苏镇江212013；2江苏大学附属镇江三院)



曲古抑菌素A对卵巢癌细胞分化、增殖的影响及其机制

赖文升1，史紫君1，万晓蕾1，薛晶1，邵根宝1，邹圣强2

(1江苏大学医学院，江苏镇江212013；2江苏大学附属镇江三院)

目的观察曲古抑菌素A(TSA)对卵巢癌细胞分化、增殖及细胞周期的影响，并探讨其机制。方法培养卵巢癌上皮细胞系HO8910，将细胞分为A、B、C、D组，分别加入0、100、200、400 nmol/L TSA。分别于培养24、48、72 h观察A、C组细胞形态变化；于培养24 h后采用Western blotting法检测四组细胞中的Y染色体上的性别决定区盒2(SOX-2)、八聚体结合转录因子4(OCT-4)和叉头样转录因子A2(FOXA-2)。分别采用MTT法及EdU染色法检测细胞增殖能力，流式细胞术检测不同周期细胞。采用Western blotting法检测各组细胞中的Cyclin D1和p21Cip1蛋白。结果A组细胞多为类圆形或椭圆形，外表规整，成簇生长。C组细胞发生形态转变，细胞密度有所下降。与A组相比，B、C、D组细胞中SOX-2、OCT-4表达下调，FOXA-2表达升高(P均<0.05)。与A组相比，B、C、D组细胞增殖率降低，G0/G1期细胞比例增高，S期细胞比例减小，Cyclin D1蛋白表达下调，p21Cip1蛋白表达上调(P均<0.05)。结论TSA可诱导卵巢癌HO8910细胞分化，抑制细胞增殖，其机制可能与调节细胞分化相关蛋白及细胞周期相关蛋白表达有关。

曲古抑菌素A；卵巢癌；细胞分化；细胞增殖；Y染色体上的性别决定区盒2;八聚体结合转录因子4；叉头样转录因子A2；细胞周期蛋白D1；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂

上皮性卵巢癌(EOC)是最常见的妇科恶性肿瘤之一[1]，70%的患者接受一线化疗后18个月内复发[2,3]，晚期患者5年生存率较低(仅为30.6%)[4]，因此迫切需要制定有效的化疗策略。分化治疗作为一种新的化疗策略，通过药物诱导恶性肿瘤细胞分化成非恶性细胞甚至正常细胞，具有巨大的潜力[5～7]。组蛋白乙酰化修饰和去乙酰化修饰是表观遗传调控的重要组成部分。组蛋白乙酰转移酶(HAT)和去乙酰化酶(HDAC)活性失衡将导致细胞周期、分化和凋亡等相关基因异常转录[8]，而HDAC抑制剂能够逆转这一作用，并促进细胞分化。曲古抑菌素A(TSA)是近年来备受关注的一种异羟肟酸型HDAC抑制剂。关于TSA与卵巢癌的关系研究主要集中在TSA的促凋亡和抑制迁移作用，但对TSA的促分化作用较少涉及。本研究观察了TSA对卵巢癌细胞分化、增殖及细胞周期的影响，并探讨其机制，为卵巢癌的分化治疗提供理论依据。

1　材料与方法

1.1细胞培养与分组卵巢癌细胞系HO8910由江苏大学邵启祥教授实验室赠予，培养于含有10% FBS和抗生素(青霉素100 U/mL、链霉素100 mg/mL)的DMEM中，并置于37 ℃、5% CO2培养箱。当细胞融合度至80%时，以2×105/mL接种于培养皿中培养过夜。将细胞分为A、B、C、D四组，分别加入0、100、200、400 nmol/L TSA。

1.2细胞形态观察分别于培养24、48、72 h用倒置显微镜观察A、C组细胞形态并用CCD相机拍照。

1.3细胞分化相关蛋白检测四组培养24 h后，采用Western blotting法检测分化相关蛋白Y染色体上的性别决定区盒2(SOX-2)、八聚体结合转录因子4(OCT-4)和叉头样转录因子A2(FOXA-2)。提取各组细胞总蛋白，经8%～12% SDS-PAGE凝胶分离和电转移至PVDF膜，转膜后由含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h，一抗孵育液4 ℃过夜，TBST洗膜3次，二抗室温孵育1 h，再用TBST洗膜3次，最后用ECL曝光液在化学发光检测器中曝光并拍照。用Image Pro Plus软件测定条带灰度值，然后计算目的蛋白条带灰度值与内参照条带灰度值的比值，表示蛋白相对表达量。

1.4细胞增殖能力检测①MTT法：四组分别于培养24、48、72 h，将20 μL的MTT加入到96孔板中，4 h后吸除培养基，加入150 μL DMSO，在摇床上摇15 min以溶解甲臜，用酶标仪测定490 nm波长处光密度值(OD值)。细胞增殖率=OD实验组/OD对照组×100%。②EdU法：取A、C组细胞，培养48 h后将50 mmol/L EdU添加到培养基中，孵育2 h，再加入DAPI进行细胞核染色，由奥林巴斯激光扫描显微镜系统拍摄照片；照片中绿色荧光为正在进行DNA复制的细胞核，对绿色荧光细胞核进行计数。

1.5不同周期细胞检测四组培养48 h后，胰酶消化细胞，PBS洗涤2遍，将细胞与DNA结合染料PI(50 g/mL)和RNase(1 mg/mL)在37 ℃恒温箱中避光孵育30 min，采用流式细胞仪分析。

1.6细胞周期相关蛋白检测各组细胞培养48 h后，采用Western blotting法检测G1细胞周期调控蛋白Cyclin D1和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21Cip1。方法参考“1.2.2”。

2　结果

2.1各组细胞形态改变A组细胞多为类圆形或椭圆形，外表规整，成簇生长。C组细胞发生类圆形—星状—梭形转变，细胞密度也有所下降。详见图1。

图1　A、C组不同培养时间细胞形态学变化(100×)

2.2各组细胞分化相关蛋白表达比较Western blotting检测显示，TSA明显下调SOX-2和OCT-4的蛋白表达水平，而诱导FOXA-2表达上调，且呈浓度依赖性。详见表1。

表1　各组细胞中SOX-2、OCT-4、FOXA2表达比较

注：与A组相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.3各组细胞增殖率比较MTT结果显示，B、C、D组细胞增殖率低于A组，且随着TSA作用浓度增大、时间延长，细胞增殖率逐渐降低(P均<0.05)。见表2。EdU染色结果显示，C组绿色荧光细胞核数较A组减少(见图2)。说明TSA可抑制HO8910细胞增殖，而非诱导细胞凋亡。

表2　各组细胞增殖率比较

注：与A组相比，*P<0.05，**P<0.01。

注：A为A组；C为C组。

图2 EdU染色后A、C组细胞增殖情况

2.4各组不同周期细胞分布比较与A组相比，B、C、D组G0/G1期细胞比例增高，S期细胞比例减小(P均<0.01)。见表3。

表3　各组不同周期细胞分布比较±s)

注：与A组相比，*P<0.01。

2.5各组细胞周期相关蛋白表达比较A、B、C、D组p21Cip1蛋白相对表达量分别为0.12±0.01、0.13±0.01、0.22±0.03、0.36±0.01，Cyclin D1蛋白相对表达量分别为0.68±0.04、0.47±0.05、0.21±0.02、0.16±0.01。与A组相比，B、C、D组细胞Cyclin D1蛋白表达下调，p21Cip1蛋白表达上调(P均<0.05)。

3　讨论

与基因突变或缺失相比，表观遗传修饰是可逆的，并不引起基因序列变化，因此成为化疗相关研究的热点[9]。HDAC抑制剂可通过上调组蛋白乙酰化水平从而诱导细胞发生分化和(或)凋亡[10]。现已证明许多HDAC抑制剂具有诱导细胞分化的能力[11]。我们利用人类卵巢癌细胞系HO8910研究TSA对恶性肿瘤细胞分化的作用，结果显示，A组细胞多为类圆形或椭圆形，外表规整，成簇生长；C组细胞发生类圆形—星状—梭形转变，细胞密度也有所下降，提示TSA可诱导HO8910细胞发生形态变化。

卵巢癌患者预后差的一部分原因可能是肿瘤干细胞的存在[12]。肿瘤干细胞具有自我更新和分化能力，在肿瘤发生、化疗耐药、肿瘤复发和转移过程中发挥重要作用[12,13]。SOX-2、OCT-4、FOXA-2等转录因子可协同调节干细胞自我更新和分化所需的基因及信号通路。据报道，SOX-2高表达可阻止人多能性NT2/D1细胞向神经元或向胶质细胞分化，成熟神经元中SOX-2的表达水平较低[14]。OCT-4表达上调也与某些低分化的恶性肿瘤有关。FOXA-2高表达则可通过提高组蛋白H3乙酰化水平从而诱导干细胞向多巴胺能神经元分化[15]。与高分化肿瘤相比，低分化肿瘤组织中更易检测到高度表达的SOX-2、OCT-4蛋白，后两者在癌旁组织及良性肿瘤组织中不表达[16]。本研究将SOX-2、OCT-4和FOXA-2作为反映卵巢癌细胞分化程度的指标，结果显示，与A组相比，B、C、D组SOX-2、OCT-4蛋白表达下调，FOXA-2蛋白表达增高，提示TSA可通过调节细胞分化相关基因表达诱导卵巢癌细胞分化，即下调SOX-2、OCT-4蛋白表达，上调FOXA-2蛋白表达。推测TSA可抑制HDAC活性，通过提高组蛋白乙酰化水平破坏电荷平衡状态，从而打开DNA双链，促进细胞谱系特异性基因的转录激活。具体机制仍需进一步研究。

细胞增殖与分化是由细胞周期中的G1期或G1/S期所控制的[17～19]。目前已知HDAC抑制剂诱导分化常伴随特定基因表达水平改变，如p21Cip1、Cyclin D1。这些基因表达水平改变可导致细胞增殖抑制和细胞周期阻滞。在参与G1期调控的细胞周期蛋白中，Cyclin D1与肿瘤发生关系最密切。Cyclin D1与CDK4的结合为G1期向S期过渡所必需，CDK抑制剂p21Cip1是细胞周期进程中的负性调节因子，可抑制G1期向S期过渡。本研究结果显示，与A组相比，B、C、D组细胞增殖率降低，G0/G1期细胞比例增高，S期细胞比例减小，Cyclin D1蛋白表达下调，p21Cip1蛋白表达上调，提示TSA能诱导细胞增殖抑制并使细胞周期阻滞，可能通过调控p21Cip1和Cyclin D1表达发挥上述作用。

综上所述，TSA可诱导卵巢癌细胞分化，抑制细胞增殖，其机制可能与调节细胞分化相关蛋白及细胞周期相关蛋白表达有关。

[1] Ignacio R,Bast RC.Minireview: human ovarian cancer: biology,current management,and paths to personalizing therapy[J].Endocrinol,2012,153(4):1593-1602.

[2] Lopez J,Banerjee S,Kaye SB.New developments in the treatment of ovarian cancer--future perspectives[J].Ann Oncol,2013,24(suppl 10):69-76.

[3] Kim A,Ueda Y,Naka T,et al.Review: Therapeutic strategies in epithelial ovarian cancer[J].J Exp Clin Cancer Res,2012,31(1):14.

[4] Zhan Q,Wang C,Ngai S.Ovarian cancer stem cells: a new target for cancer therapy.[J].Biomed Res Intern,2013,2013(1):916819.

[5] Leszczyniecka M,Roberts T,Dent P,et al.Differentiation therapy of human cancer: basic science and clinical applications[J].Pharmacol Ther,2001,90(s 2-3):105-156.

[6] Shen ZX,Shi ZZ,Fang J,et al.All-trans retinoic acid/As2O3 combination yields a high quality remission and survival in newly diagnosed acute promyelocytic leukemia[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(15):5328-5335.

[7] Zhang JW,Gu J,Wang ZY,et al.Mechanisms of all-trans retinoic acid-induced differentiation of acute promyelocytic leukemia cells[J].J Biosci,2000,25(3):275-284.

[8] Michael H,Montgomery RL,Olson EN.The many roles of histone deacetylases in development and physiology: implications for disease and therapy[J].Nat Rev Genet,2009,10(1):32-42.

[9] Wang LT,Liou JP,Li YH,et al.A novel class I HDAC inhibitor,MPT0G030,induces cell apoptosis and differentiation in human colorectal cancer cells via HDAC1/PKCδ and E-cadherin[J].Oncotarget,2014,5(14):5651-5662.

[10] Kretsovali A,Hadjimichael C,Charmpilas N.Histone deacetylase inhibitors in cell pluripotency,differentiation,and reprogramming[J].Stem Cells Int,2012,2012(1):21-32.

[11] Cruz FD,Matushansky I.Solid tumor differentiation therapy - is it possible?[J].Oncotarget,2012,3(5):559-567.

[12] Marius Eugen C,Ada Maria G,Stefana Oana P,et al.Cancer stem cells: biological functions and therapeutically targetingr[J].Int J Mol Sci,2014,15(5):8169-8185.

[13] Kwon MJ,Shin YK.Regulation of ovarian cancer stem cells or tumor-initiating cells.[J].Int J Mol Sci,2013,14(4):6624-6648.

[14] Klajn A,Drakulic D,Tosic M,et al.SOX2 overexpression affects neural differentiation of human pluripotent NT2/D1 cells[J].Biochemistry (Mosc),2014,79(11):1172-1182.

[15] Bang SY,Kwon SH,Yi SH,et al.Epigenetic activation of the foxa2 gene is required for maintaining the potential of neural precursor cells to differentiate into dopaminergic neurons after expansion[J].Stem Cells Dev,2014,24(4):520-533.

[16] Li WX,Wang JG,Xu ZY,et al.Expression of sox2 and oct4 and their clinical significance in human non-small-cell lung cancer[J].Int J Mol Sci,2011,13(6):7663-7675.

[17] Yang Q,Fu HW,Hu Y.Correlation between the level of HE4,CA125 and pathalogical classification in the diagnosis of ovarian cancer[J].Exp Lab Med,2013,31(6):538-540.

[18] Gaspar MJ,Diez M,Rodriguez A,et al.Clinical value of CEA and CA125 regarding relapse and metastasis in resectable non-small cell lung cancer[J].Anticancer Res,2003,23(4):3427-3432.

[19] Li Y,Yin W,Wang X,et al.Cholera toxin induces malignant glioma cell differentiation via the PKA/CREB pathway[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(33):13438-13443.

Effect of TSA on differentiation and proliferation of ovarian cancer cells and its mechanism

LAI Wensheng1,SHI zijun,WAN Xiaolei,XUE Jing,SHAO Genbao,ZOU Shengqiang

(1 Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

ObjectiveTo observe the effect of trichostatin A (TSA) on the differentiation,proliferation and cell cycle of ovarian cancer cells and to investigate its mechanism.MethodsEpithelial ovarian cancer cell line HO8910 was cultured and divided into groups A,B,C and D,respectively,which were added with 0,100,200 and 400 nmol/L TSA.Cell morphology of groups A and C were observed at 24 h,48 h and 72 h after culture.The expression of sex-determining region Y chromosome cassette-2 (SOX-2),octamer binding transcription factor 4 (OCT-4) and fork-like transcription factor A2 (FOXA2) in the four groups was detected by using Western blotting 24 hours after culture.The cell proliferation was detected by MTT and EdU staining,distribution of cell cycle was detected by flow cytometry and the expression of Cyclin D1 and p21Cip1protein was detected by Western blotting.ResultsCells in the group A were mostly round or oval,looked neat and grew in clusters.While cell morphology in the group C changed and cell density decreased.Compared with group A,the expression of SOX-2 and OCT-4 in the groups B,C and D were decreased,FOXA-2 expression was increased (all P<0.05).Compared with group A,the cell proliferation rates were decreased,the proportion of cells in G0/G1phase was increased,the proportion of cells in S phase was decreased,the expression of Cyclin D1 was decreased and the expression of p21Cip1protein in the groups B,C and D was increased (all P<0.05).ConclusionTSA can induce ovarian cancer cell differentiation and inhibit the cell proliferation,which may be related to the regulation of cell differentiation-related and cell cycle-related proteins.

trichostatin A; ovarian carcinoma; cell differentiation,cell proliferation; sex-determining region Y chromosome cassette-2; octamer binding transcription factor 4; fork-like transcription factor A2; Cyclin D1; cyclin-dependent kinase inhibitor

国家自然科学基金资助项目(81170573)。

赖文升(1986-)，男，在读研究生，主要研究方向为肿瘤学。E-mail：405560193@qq.com

简介：邹圣强(1968-)，男，主任医师，主要研究方向为重症医学。E-mail：1210xyz@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.19.003

R737.31

A

1002-266X(2016)19-0008-04

2015-11-25)