耐甲氧西林金黄色葡萄球菌外排系统抑制剂的中药筛选

安尉，王迪，谢鲲鹏，谢明杰

(辽宁师范大学生命科学学院 辽宁省生物技术与分子药物研发重点实验室，辽宁 大连 116081)

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌外排系统抑制剂的中药筛选

安尉†，王迪†，谢鲲鹏，谢明杰Δ

(辽宁师范大学生命科学学院 辽宁省生物技术与分子药物研发重点实验室，辽宁 大连 116081)

目的从中药中筛选耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillinresistantstaphylococcusaureus，MRSA)外排系统的抑制剂。方法采用头孢西丁纸片法和PCR法鉴定供试菌株的耐药性及其外排基因norA与qacA/B；采用平板打孔法测定中药对MRSA41577的抑菌作用；采用联合药敏试验和双平板法测定中药对MRSA41577外排系统的抑制作用。结果MRSA41577为耐药菌株，菌株内含有norA及qacA/B外排基因；24种中药粗提物中有22种对MRSA41577有抑制作用，只有水飞蓟和穿心莲对MRSA41577无抑制作用；联合药敏试验结果显示，水飞蓟和穿心莲分别与MRSA41577的耐药底物环丙沙星和苯扎氯铵联合作用后，均能恢复细菌对2种药物的敏感性，其中32 mg/mL的水飞蓟和穿心莲分别与环丙沙星和苯扎氯铵联用后，能使环丙沙星抑制MRSA41577的MIC由128 μg/mL均降低至4 μg/mL以下，苯扎氯铵抑制MRSA41577的MIC由4 μg/mL分别降低至0.5 μg/mL和1 μg/mL；双平板结果显示，在含有终浓度为32 μg/mL的环丙沙星和2 μg/mL的苯扎氯铵平板中，加入水飞蓟和穿心莲后，能恢复环丙沙星和苯扎氯铵对MRSA41577的抑制作用。结论水飞蓟和穿心莲是MRSA41577的外排系统抑制剂。

中药；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；外排系统；抑制剂

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillinresistantstaphylococcusaureus,MRSA)的感染几乎遍及全球，已成为医院内感染的重要病原菌之一，与艾滋病、乙肝共同成为世界三大最难解决的感染性疾病[1-2]。MRSA除了对甲氧西林耐药外，对β-内酰胺类、头孢类、氨基糖苷类和大环内酯类等类型抗生素也产生不同程度的耐药，为多重耐药菌[3]。研究表明,主动外排系统是细菌产生多重耐药性的主要原因[4]。目前已知一些能够抑制细菌外排系统的抑制剂，如利血平和奥美拉唑等，但这些药物都具有一定的毒性，因此筛选得到高效低毒的外排系统抑制剂是解决细菌耐药性的有效途径[5-6]。中国中草药资源十分丰富，具有低毒或无毒、作用靶位多，不易产生耐药性等特点[7]，因此中药是获得MRSA外排泵抑制剂的重要来源之一。本文拟从24种中药粗提物中通过平板打孔法、联合药敏法和双平板法筛选对MRSA41577外排系统具有抑制作用的药物，旨在为中药开发外排系统的抑制剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细菌：MRSA41577细菌株由大连市中心医院提供。质控菌株S.aureus ATCC25923购自中国医学菌种保藏中心。

1.1.2 试剂：中药粗提物由辽宁师范大学中药现代化实验室提供；头孢西丁纸片和利血平标准品购于大连诺威信生物技术有限公司；氯代三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)和环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)购于上海生工生物有限公司；苯扎氯铵(benzalkonium chloride，BEN)由大连三星化学公司提供；引物及PCR反应相关试剂购于宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 中药粗提物制备方法：称取一定量的待测中草药，用索氏提取器以95%的乙醇热回流提取8 h后将提取液浓缩制成干粉。精确称取一定量的干粉，将其用无水乙醇配制成一定浓度的母液，0.22 μm滤器过滤后备用。

1.2.2 菌株耐药性的检测[8]：采用头孢西丁纸片法鉴定MRSA41577的耐药性。PCR扩增法检测2种外排基因norA和qacA/B。

1.2.3 24种中药粗提物对MRSA41577的抑制作用：采用平板打孔法测定[9]：首先制备LB底层固体培养基平板，将含有150 μL浓度为107cfu/mL的MRSA41577菌悬液和5 mL的LB半固体培养基到上层，待凝固后用直径6 mm打孔器打孔并取出孔内琼脂块，然后用1滴固体培养基封底，以防药液外溢。最后在孔内分别加入200 μL的20种中药粗提物，37 ℃下培养24 h。以等体积的无水乙醇为对照组。待培养结束后用卡尺测量抑菌圈直径，实验重复3次。

1.2.4 联合药敏试验测定中药对MRSA41577外排系统的抑制作用：采用TTC法测定[10]:于96孔板中分别加入100 μL浓度为105cfu/mL的MRSA41577菌悬液，再加入10 μL待测定的中药粗提物、环丙沙星和苯扎氯铵，使待测中药粗提物的终浓度分别为0.25～32 mg/mL，环丙沙星的终浓度为4～256 μg/mL，苯扎氯铵的终浓度为0.5～8 μg/mL。37 ℃下120 r/min恒温培养24 h。待培养结束后分别加入20 μL 0.2%的TTC，37 ℃下避光培养4h后观察培养基颜色的变化，以不加药物的孔为空白对照，以外排泵抑制剂利血平为阳性对照。实验重复3次。

1.2.5 双平板法[11]测定中药对MRSA41577主动外排系统的抑制作用：制备双层平板：底层平板为20 mL的LB固体培养基，上层平板分别为200 μL浓度为107cfu/mL的MRSA41577菌悬液、5 mL的LB半固体培养基和终浓度分别为32 μg/mL的环丙沙星和2 μg/mL的苯扎氯铵。待培养基凝固后，用干净的打孔器在平板上均匀打孔，并用一滴固体培养基封底。在孔中分别加入80 μg的阳性对照利血平和10 mg的水飞蓟和穿心莲，恒温培养24 h后观察并记录结果。以上层平板中不加环丙沙星和苯扎氯铵为空白对照，实验重复3次。

2 结果

2.1 MRSA41577的鉴定结果 头孢西丁纸片法结果显示，MRSA41577菌株为耐药菌株。PCR结果显示MRSA41577中含有norA及qacA/B 2种外排基因，推测MRSA41577的耐药性与norA和qacA/B外排基因的存在有关。

2.2 24种中药对MRSA41577抑制作用 实验结果显示，24种中药粗提物中有22种对MRSA41577具有不同程度的抑制作用，只有水飞蓟(SM)和穿心莲(AP)对MRSA41577无抑制作用。见表1。

表1 24种中药对MRSA41577的抑菌作用Tab.1 The antibacterial effect of 24 kinds of Chinese crude extract on MRSA41577

具有抑菌活性和无抑菌活性的中药都可能是细菌外排泵抑制剂，本实验考虑到有抑菌活性的中药粗提物会对后续的联合药敏实验结果存在干扰，因此本文只对无抑菌活性的水飞蓟和穿心莲对MRSA41577外排系统的抑制作用进行研究。

2.3 联合药敏试验检测水飞蓟和穿心莲对MRSA41577外排系统的抑制作用 实验结果显示，水飞蓟和穿心莲在浓度2～64 mg/mL范围内对MRSA41577均无抑制作用，但水飞蓟和穿心莲分别与环丙沙星和苯扎氯铵联用后，可以降低环丙沙星和苯扎氯铵抑制MRSA41577的MIC。其中32 mg/mL的水飞蓟和穿心莲能使环丙沙星抑制MRSA41577的MIC均由128 μg/mL降低至4 μg/mL以下。见表2。32 mg/mL的水飞蓟和穿心莲能使苯扎氯铵的MIC由4 μg/mL分别降低至0.5 μg /mL和1 μg /mL。见表3。

表2 水飞蓟和穿心莲与环丙沙星的协同作用

“+”，有菌生长，bacteria growth；“-”，无菌生长，no-bacterial growth

表3 水飞蓟和穿心莲与苯扎氯铵的协同作用Tab.3 The synergistic effect of BEN combination with SM and AP

“+”，有菌生长，bacteria growth；“-”，无菌生长，no-bacterial growth

以上结果表明水飞蓟与穿心莲均能恢复MRSA41577对环丙沙星和苯扎氯铵的敏感性，由此推测水飞蓟和穿心莲能够抑制MRSA41577的外排系统。

2.4 双平板法检测水飞蓟和穿心莲对MRSA41577外排系统的抑制作用 实验结果显示，水飞蓟和穿心莲在不含环丙沙星和苯扎氯铵的平板中不能形成抑菌圈，但在含有终浓度为32 μg/mL的环丙沙星和2 μg/mL的苯扎氯铵平板中，则能恢复环丙沙星和苯扎氯铵对MRSA41577的抑制作用，抑菌圈直径均在12 mm以上，其中水飞蓟的作用效果与利血平接近。表明水飞蓟和穿心莲是MRSA41577良好的外排泵抑制剂。见表4。

表4 水飞蓟和穿心莲对MRSA41577主动外排系统的作用Tab.4 The effect of SM and AP on MRSA41577 efflux system

3 讨论

通过筛选和研发外排泵抑制剂阻止外排泵对药物及毒物的外排作用，已成为恢复细菌对抗生素敏感性的重要手段[12-13]。研究显示，许多中药是细菌的外排泵抑制剂[14-15]。能显著降低耐药菌的MIC是主动外排系统的存在的标志，本文的联合药敏试验结果显示，水飞蓟和穿心莲分别与MRSA41577的耐药底物环丙沙星和苯扎氯铵联合作用后，均能恢复细菌对2种药物的敏感性，其中32 mg/mL的水飞蓟和穿心莲与环丙沙星联用后，能使环丙沙星抑制MRSA41577的MIC降低32倍以上，苯扎氯铵的MIC降低4倍以上。双平板实验结果与联合药敏试验结果一致，其中水飞蓟抑制MRSA41577外排系统的抑制作用优于穿心莲。关于2者抑制MRSA41577外排系统的作用机制有待于进一步的研究。

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(编校：苗加会)

Screeningofmethicillin-resistantstaphylococcusaureuseffluxsysteminhibitorsfromtraditionalChinesemedicine

AN Wei†, WANG Di†, XIE Kun-peng, XIE Ming-jieΔ
(School of Life Sciences, Liaoning Normal University, Key Laboratory of Biotechnology and Drug Discovery of Liaoning Province, Dalian 116081, China)

ObjectiveTo screen MRSA efflux system inhibitors from traditional Chinese medicine.MethodsCefoxitin paper method and PCR method using resistance for the identification of strains and efflux gene of norA and qacA/B.Traditional Chinese medicine was evaluated by plate punching method for MRSA41577 bacteriostatic action.The inhibition of MRSA41577 efflux system was determined by combined chemosensitivity test and double-plate method.ResultsMRSA 41577 is a drug resistant strain, whith contained the efflux genes norA and qacA/B.22 of 24 traditional chinese medicine showed inhibitory action to MRSA41577, only silymarin and AndrogrAphis paniculata have no inhibitory effect on MRSA41577.The results of combined chemosensitivity test showed that silymarin and Andrographis paniculata combinated with drug-resistant substrates of MRSA41577 Ciprofloxacin and benzalkonium chloride respectively,can restore the sensitivity of bacteria to the two drugs.Silymarin and andrographis paniculata at 32 mg/mL combined with ciprofloxacin and benzalkonium chloride respectively reduced the MIC of ciprofloxacin to MRSA41577 from 128 μg/mL to 4 μg/mL,the MIC of benzalkonium chloride decreased from 4 μg/mL to 0.5 μg/mL and 1 μg/mL respectively.The results of the double-plate assay showed that, in the plate with ciprofloxacin at 32 μg/mL of final concentration and benzalkonium chloride at 2 μg/mL, the inhibitory effect of ciprofloxacin and benzalkonium chloride on MRSA41577 was restored when silymarin and andrographis paniculata were added.ConclusionSilymarin and andrographis paniculata are efflux system inhibitors of MRSA41577.

traditional chinese medicine;methicillinresistantstaphylococcusaureus; efflux system; inhibitors

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.10.006

辽宁省教育厅科学研究一般项目(L201683675)；辽宁省自然科学基金项目(201602462)

安尉，女，本科，研究方向：生物科学，E-mail：836315071@qq.com；王迪，共同第一作者，女 ，硕士在读，研究方向：微生物生化，E-mail：momoxiaodi@sina.com；谢明杰，通信作者，女，博士，教授，研究方向：微生物生化，E-mail：xmj1222@sina.com。

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