补肾健脾中药复方对成骨细胞中ASK1、ERO1、Caspase-12调节作用*

陈水昌 李 颖（广东省中西医结合医院沙头分院骨科佛山528208）

补肾健脾中药复方对成骨细胞中ASK1、ERO1、Caspase-12调节作用*

陈水昌 李 颖
（广东省中西医结合医院沙头分院骨科佛山528208）

目的：探讨补肾健脾中药复方对成骨细胞中ASK1、ERO1、Caspase-12调节作用机制。方法：将新西兰大白兔9只随机分为中药组、西药组、空白组，每组3只。三组分别用中药提取液、雌二醇混悬液按中药剂量和同体积（约10 ml）蒸馏水灌胃，1个月后抽取含药血浆。选用1 d龄SD大鼠获取原代的成骨细胞体外培养，分为中药组、西药组、凋亡空白组、正常空白组。中药组、西药组分别给予对应的含药血浆培养；凋亡空白组和正常空白组均给予常规血清培养。24 h后检测ASK1、ERO1和Caspase-12含量。结果：在ASK1方面，中药组、西药组与凋亡空白组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；且西药组比中药组更能显著降低ASK1 mRNA的表达，其差异有统计学意义（P＜0.05）。在ERO1方面，中药组、西药组与凋亡空白组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），且西药组比中药组更能显著降低ERO1蛋白的表达，其差异有统计学意义（P＜0.05）。在Caspase-12方面，中药组、西药组与凋亡空白组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：补肾健脾中药复方通过ASK1、ERO1所介导的方式对成骨细胞的凋亡进行调控。

成骨细胞；中药复方；ASK1；ERO1；Caspase-12

细胞衰老的过程是内质网应激反应（Endoplasmic Reticulum Stress，ERS）持续的过程。内质网通过激活非折叠蛋白反应以保护由应激所引起的细胞损伤，减轻内质网负担，恢复细胞功能，但如果应激刺激过于强烈、持久，内环境紊乱无法纠正，则相应凋亡机制被激活并诱导细胞发生凋亡［1］。本项目通过补肾健脾中药复方对体外培养的成骨细胞内非折叠蛋白反应介导的细胞凋亡方式进行初步的研究，探讨补肾健脾中药复方调控成骨细胞凋亡的作用机制。

1实验方法

1.1实验动物培养细胞用1 d龄SPF级健康雌性SD大鼠20只；制备药物血清用新西兰大白兔9只，体重2.0～2.2 kg。实验动物由广州中医药大学动物中心提供。

1.2实验药物补肾健脾中药复方由淫羊藿、补骨脂、丹参、黄芪等10味中药组成，该方所含生药量为1.43 kg/L，由广州中医药大学附属骨伤科医院制剂室提供。戊酸雌二醇片，由拜耳医药保健有限公司广州分公司提供（国药准字J20080036，批号：177A12）。

1.3含药血浆的制备新西兰大白兔9只，随机分为中药组、西药组、空白组，每组3只。三组大白免连续灌胃1周，最后一次灌胃后2 h，分别行心脏采血，将获得的全血置于含抗凝剂的试管中，5～10 min后，于3 000 r/min离心15 min，吸取上清，即获取含

1.4成骨细胞的培养1 d龄SD大鼠，75％酒精浸泡15 min，取出头盖骨，剔净附着软组织，0.25％胰蛋白酶预消化，0.1％Ⅱ型胶原酶消化，离心，获取细胞，PBS液冲洗，置含10％NCS-MEM培养液中，37℃、5％CO2中静置培养，每2天更换培养液1次，弃去原培养液，加入含10％的胎牛血清MEM进行培养，培养4～7 d，单层细胞铺满培养瓶底。传代时，弃去原培养液，用D-Hank's液冲洗，0.25％胰蛋白酶消化，弃去消化液，加入培养液，吹打培养瓶底，使细胞脱落，制成细胞悬液，接种于新的培养瓶，置37℃、5％CO2中静置培养。

1.5诱导细胞凋亡采用紫外线诱导细胞凋亡的方法。采用紫外线照射成骨细胞10 min，照射过程中以0.5 ml D-Hank's液湿润皿底，以保持皿底不干，照射后中药组和西药组分别给予对应的含药血浆培养；凋亡空白组和正常空白组均给予常规血清培养。24 h后，收集成骨细胞做下一步实验。正常空白组不用紫外线照射。

1.6指标检测采用酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）检测Caspase-12的含量，采用荧光定量PCR（Realtime Fluorescence Quantitative PCR，RTFQ PCR）检测ASK1的含量，采用光密度（OD值）的方法检测ERO1的含量。

1.7统计学方法采用SPSS16.0软件包进行分析，计量资料用（±s）表示，先进行正态性分析，符合要求后各组间差异分别采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有显著意义。

2实验结果

2.1成骨细胞凋亡率与细胞周期变化与正常空白组相比，中药组、西药组、凋亡空白组G0/G1、G2/M期细胞增多，S期细胞明显减少。中药组、西药组、凋亡空白组细胞凋亡率较正常空白组显著增高（P＜0.05），其中凋亡空白组凋亡率最高，与其他三组差异明显（P＜0.05），有统计学意义。西药组凋亡率略低于中药组（P＞0.05）。见表1。

表1　紫外线对成骨细胞凋亡与细胞周期的影响（±s）

表1　紫外线对成骨细胞凋亡与细胞周期的影响（±s）

组别G0/G1SG2/M凋亡率（％）中药组西药组凋亡空白组正常空白组45.596±2.328 45.792±2.251 44.181±1.959 39.335±1.789 43.528±2.981 41.069±2.731 46.835±1.396 53.987±2.970 10.880±1.27 13.14±1.427 8.986±1.775 6.673±1.383 8.284±0.541 7.745±0.962 10.15±0.838 3.728±0.830

2.2蛋白表达的变化在Caspase-12方面，中药组、西药组与凋亡空白组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。在ERO1方面，中药组、西药组与凋亡空白组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），且西药组比中药组更能显著降低ERO1蛋白的表达，其差异有统计学意义（P＜0.05）。在ASK1 mRNA方面，中药组、西药组与凋亡空白组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），且西药组比中药组更能显著降低ERO1蛋白的表达，其差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2　各组ASK1 mRNA、ERO1、Caspase-12表达情况（±s）

表2　各组ASK1 mRNA、ERO1、Caspase-12表达情况（±s）

注：与凋亡空白组比较，*P＜0.05；与中药组比较，#P＜0.05。

组别Caspase-12（pmol/L）ERO1ASK1 mRNA中药组西药组凋亡空白组正常空白组11.987±4.133 12.192±3.168 12.118±3.211 10.481±2.871 1.216±0.234*0.983±0.110*#1.351±0.191 0.640±0.102 3.14±0.24*2.21±0.33*#4.56±0.61 1.45±0.86

3讨论

骨质疏松症是一种衰老的疾病。衰老是在正常状况下生物发育成熟后，随年龄增加，自身机能减退，内环境稳定与应激能力下降，结构、组分渐进退变。衰老过程在整体、组织、细胞和分子水平皆有所体现，随年龄增加，器官、组织的实质细胞数、反应敏感性及功能均逐步下降。Naidoo等［2］的实验证实当衰老发生时，内质网应激的保护效应减退，损害效应增强。而内质网应激能加速衰老，因为内质网应激能导致细胞功能下降和凋亡。错误和未折叠蛋白的积累激活内质网应激反应，过度应激导致凋亡，适度的反应最终减轻损害，保护细胞，但却是以细胞功能的丢失为代价。目前研究表明，非折叠蛋白反应介导的细胞凋亡有三条主要的途径：（1）CHOP/GADD153途径：CHOP/GADD153（GrowthArrestand DNA-damage-inducible Gene 153）是内质网应激特异的一个转录因子，属于C/EBP转录因子家族成员。在细胞处于应激状态下，CHOP的表达量大大增加并聚集在细胞核内。CHOP能激活GADD34、ERO1和死亡受体DR5等凋亡反应蛋白过量表达的CHOP能促进细胞凋亡［3］。（2）Caspases-12途径：Caspases-12定位于内质网外膜，是介导内质网应激凋亡的关键分子。内质网应激引起Caspase-12激活，激活的Caspase-12切割并激活Caspase-9，启动Caspase级联反应，激活各种下游Caspase，诱导凋亡［4］。（3）ASK1/JNK途径：ASK1是细胞丝裂原活化蛋白激酶中的一种。活化的ASK1又依次激活MKK4/MKK7-JNK和MKK3/MKK6-p38激酶途径，对应激做出应答或促使细胞凋亡［5］。

内质网氧化还原酶-1（Endoplasmic Reticulum Oxidoreductin 1，ERO1）主要参与维持ER内氧化状态，是调控内质网腔中蛋白合成、折叠的关键基因。ERO1参与氧化二硫键异构酶，维持蛋白折叠过程能够持续进行。ERO1在形成二硫键的过程中可产生H2O2，因此Ozgur等［6］认为ERO1激活是细胞内活性氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS）产生的重要来源之一。过多的ROS产生，超过细胞抗氧化防御能力就会影响细胞内氧化还原稳态，引起氧化应激和ERS等过程。目前有研究发现，ERO1同源异构体ERO1 a限制胰岛素原突变体诱导的ERS，且ERO1 a蛋白可能参与高血压诱导的血管内皮细胞损伤，并可以作为ERS导致细胞凋亡通路的重要标志蛋白。

凋亡信号调节激酶1（Apoptosis Signal-regulating Kinase 1，ASK1）是细胞丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase，MAP3Ks）家族成员之一。在疾病发生发展的过程中，由于致病因子的持续刺激，使ASK1处在持久异常活化的状态，导致组织细胞损伤。多种内源性和外源性刺激均可激活ASK1，异常活化的ASK1参与了多种疾病的病理过程。众多学者认为心脏由代偿性心肌肥厚发展为心力衰竭的过程中，心肌细胞凋亡起着重要作用。慢性心力衰竭时，ASK1参与凋亡信号传导，导致心肌细胞凋亡

［7～8］。

Caspase是一类一、二级结构相似的半胱氨酸蛋白酶，是细胞凋亡过程中一组关键的蛋白酶，是哺乳动物细胞凋亡的启动和执行者［9］。内质网应激介导细胞凋亡调节的一个主要因素是Caspase-12，通过激活的Caspase-12切割并激活Caspase-9酶原，这一过程需与另外内质网应激分子协同作用，活化后的Caspase-9通过对Caspase-3酶原等Caspase效应分子的活化，切割多ADP聚合酶（PARP）和多种其它细胞内的底物，最终导致细胞凋亡［10］。

中医学认为骨质疏松症属“骨痿”，根据肾主骨的理论，其病因病机，当首责于各种原因导致肾（气、阴、阳）的不足，影响骨髓和血之化源，精不生髓，骨失髓血充养，易发生骨骼脆弱无力之证。补肾健脾中药复方经过临床及科研实践［11～13］具有补肾壮骨、健脾益气、活血化瘀之功效，方中以补骨脂补肾助阳壮骨为君药；肉苁蓉、淫羊藿、菟丝子加强补肾阳之功为臣药；佐以黄芪补中益气，丹参、当归活血化瘀，熟地、白芍滋阴益精。在本研究中，中药组和西药组相比，两者均可以降低ASK1 mRNA、ERO1蛋白的含量，与凋亡空白组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。但在Caspase-12方面，两组与凋亡组比较，差异无统计学意义。因此，我们可以认为，补肾健脾中药复方可能是通过CHOP/GADD153途径和ASK1/JNK途径对成骨细胞的凋亡进行调控，这对于中药复方治疗骨质疏松症具有重要的意义。

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Effects of Chinese Medicine for Bushenjianpi on ASK1，ERO1 and Caspase-12 in Osteoblasts

CHEN Shui-chang，LI Ying
（The Department of Orthopedics，the Shatou Branch Hospital of Guangdong Province Traditional Chinese and Western Medicine，Foshan528208）

Objective：To explore the effects of chinese medicine for Bushenjianpi on ASK1，ERO1 and Caspase-12 in osteoblasts. Methods：9 New Zealand rabbits were randomly divided into the chinese medicine group（n=3），the western medicine group（n=3）and the control group（n=3）.The chinese medicine group was given the intragastric administration with chinese herbal compound.The western medicine group was given the alendronate sodium，the control group was given distilled water.After treament for 1 month，the plasma was separated from blood.1 Day old SD rats were used to culture osteoblasts，which were divided into the chinese medicine group，the western medicine group，the apoptosis group and the control group.The chinese medicine group and the western medicine group were given the corresponding plasma，other group were given serum culture.After 24 h，GADD34、ERO1、IRE-1 were examined.Results：Compared with the apoptosis group，the chinese medicine group and the western medicine group could decrease the expression level of ASK1 and ERO1 in serum obviously（P＜0.05）.Compared with the chinese medicine group in ASK1 and ERO1，the western medicine group could decrease the expression level obviously（P＜0.05）.But compared with the apoptosis group，there was no statistical significance in Caspase-12. Conclusion：Chinese medicine for Bushenjianpi is regulated by ASK1 and ERO1 in the way of apoptosis.

Osteoblasts；Chinese herbal compound；ASK1；ERO1；Caspase-12

R285.5

Bdoi：10.13638/j.issn.1671-4040.2016.04.042

广东省科技计划项目（编号：2013B021800162）；广东省佛山市医学类科技攻关项目（编号：201308180）药血浆，再灭活，抽滤除菌，置-20℃保存备用。

（2016-03-18）