枯草芽孢杆菌B91产芽孢发酵条件优化

陈静宇，李　晶，2，张淑梅，2，孟利强，2

（1.黑龙江省科学院微生物研究所黑龙江省生物工程重点实验室，哈尔滨 150010；2.黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨 150020）

枯草芽孢杆菌B91产芽孢发酵条件优化

陈静宇1，李晶1，2，张淑梅1，2，孟利强1，2

（1.黑龙江省科学院微生物研究所黑龙江省生物工程重点实验室，哈尔滨 150010；2.黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨 150020）

在三角瓶培养条件下，采用单因素实验对枯草芽孢杆菌B91发酵条件装液量、起始pH值及温度进行了优化。在此基础上进行了响应面分析，获得了响应面回归模型，模型拟合良好，确定了菌株B91最佳的产孢发酵条件为装液量44.7 mL、初始pH 8.3、温度31.5℃。在最优条件下发酵培养，芽孢浓度为44.89亿±0.29亿/mL，较优化前提高了36.4%。

枯草芽孢杆菌；芽孢；响应面；发酵条件；优化

枯草芽孢杆菌是目前研究最为深入的一种芽孢杆菌，它能产生多种抗菌物质，现已广泛应用于医药工业、畜牧业及植物病害防治等领域［1］。且多数菌株对人类和环境都具有很好的安全性，所以近年来枯草芽孢杆菌成为食物病害防治领域的研究热点，国内外已有较多报道［2］。而枯草芽孢杆菌活菌制剂的活菌数量是其制剂稳定性的重要保障，所以微生态制剂中活菌数的降低直接影响其使用效果，这一问题可以通过提高活菌制剂中的芽孢比例得以缓解［3］。通过调控发酵条件提高发酵液中芽孢的比例，芽孢具有较好的抗逆性，可以抵抗外界的环境压力，可以提高活菌制剂的稳定性，保证其使用效果［4］。

本研究所用菌株枯草芽孢杆菌B91是本实验室的自有菌株，能够抑制多种植物病原菌，具有较好的田间防效，具有广泛的应用前景。本文对其发酵条件进行优化，提高其发酵液中菌体密度及芽孢形成率，为下一步扩大生产打下基础。

1　材料与方法

1.1实验菌种

枯草芽孢杆菌B91菌株由本实验室提供。

1.2发酵培养基

葡萄糖9.4 g/L，酵母膏6.9 g/L，氯化钠3 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO40.2 g/L，MnSO410.2 mg/L，CaCO30.2 g/L，培养基采用湿热灭菌：121℃，15 min。

1.3培养方法

1.3.1种子活化及培养

种子活化及培养参照文献［5］。

1.3.2发酵培养

接种量均为1%，250mL的三角瓶装液量为50 mL，摇床转速为150 rpm，30℃下培养48 h。

1.4芽孢计数

沸水浴处理待测样品20 min，灭活未形成芽孢的营养体，冷却后采用菌落计数法计数测得样品芽孢数［6］。

1.5单因素实验

选择装液量、发酵液初始pH值、发酵温度作为主要优化因素，装液量分别设为30 mL、50 mL、70 mL、90 mL，发酵pH值分别设为5、6、7、8、9，发酵温度分别设为28℃、31℃、34℃、37℃、40℃。

1.6响应面分析

采用Box-Behnken设计，在摇瓶发酵条件下优化三个发酵条件：装液量、pH、温度，设计3因素3水平的响应面分析试验（表1）。

表1　Box-Behnken设计因子代码与水平Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken design

2　结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1装液量对芽孢数量的影响

图1　装液量对芽孢数量的影响Fig.1 Effects of volume loading on the concentration of spores

在摇瓶发酵过程中，装液量直接关系发酵液的溶氧系数，装液量越少溶氧越高，反之亦然。如图1所示，摇瓶的装液量对芽孢形成数量影响显著（P＜0.05），装液量为50 mL/250mL时芽孢数量最多，达到40.9亿/mL，当装液量继续增加时，由于溶氧降低，抑制了芽孢的形成，所以芽孢形成数量减少。

2.1.2初始pH对芽孢数量的影响

图2　初始pH对芽孢数量的影响Fig.2 Effects of initial pH on the concentration of spores

如图2所示，发酵初始pH值对芽孢形成的影响变化趋势，当发酵初始pH值在5～7，芽孢形成数量迅速增加，而当发酵初始pH值为8时芽孢数量达到最大42.1亿/mL，随着发酵初始pH值继续增加，芽孢数量呈逐渐下降趋势，所以初始pH 8设为响应面试验中心试验点。

2.1.3发酵温度对芽孢数量的影响

图3　发酵温度对芽孢数量的影响Fig.3 Effects of temperature on the concentration of spores

发酵温度影响菌体的生长繁殖，如图3所示，发酵温度31℃时芽孢形成数量最多，为43.5亿/mL，随着发酵温度的升高芽孢数量呈下降趋势，所以选择发酵温度30℃进行响应面实验。

2.2响应面法优化发酵条件

响应面试验结果见表2，经过多元回归拟合，获得的芽孢数 （Y）对X1、X2和X3三个自变量的三元二次回归模型方程：Y=44.54-3.1375A-0.125B+1.2375C -2.625AB-1.7AC+1.625BC-6.17A2-1.595 B2-6.82 C2。利用软件Design Expert 8.0进行求导，解出极值点，算出每个因素的最佳值：装液量为44.74 mL、初始pH为8.34、温度为31.52℃，此时模型的理论最优芽孢浓度为45.18亿/mL。

表2　响应面试验设计与结果Tab.2 Response surface design and results

表3为回归模型方差分析结果，由结果可知模型是显著的 （P≤0.0001），并且决定系数为0.9832，说明该模型是准确可靠的，因此，可用此模型对枯草芽孢杆菌B91的发酵条件进行分析和预测［6，7］。

表3　响应面试验设回归分析Tab.3 Analysis of variance of response surface design

以回归方程为基础，采用软件分析绘制两两因素间相应的响应面分析图（图4～6），响应曲面的极值点是两个因素交互的最大值，根据响应面分析结果，枯草芽孢杆菌B91菌株芽孢浓度最优极值点为装液量为44.7 mL、初始pH为8.3、温度为31.5℃，预测最优值为45.18亿/mL。

图4　装液量和pH交互作用对芽孢数影响Fig.4　Response surface plot of spores concentration versus volume loading and pH

图5　装液量和温度交互作用对芽孢数影响Fig.5　Response surface plot of spores concentration versus volume loading and temperature

图6　pH和温度互作用对芽孢数影响Fig.6　Response surface plot of spores concentration versus pH and temperature

3　讨论与结论

培养条件对于细菌的繁殖，尤其是芽孢的产生尤为重要，在单因素实验中发现最适合B91菌株摇瓶发酵的条件为装液量50 mL/250mL，初始pH值8，发酵温度30℃，在此基础上发酵48h芽孢形成较好为43.5 亿/mL。在上述条件基础上设计了响应面实验，响应回归模型的决定系数为0.9832，说明该模型拟合程度良好，最优培养条件为装液量44.74 mL、初始pH 8.34、温度31.52℃。在最优条件下发酵培养，芽孢浓度为44.89亿±0.29亿/mL与模型的理论最优芽孢浓度为45.18亿/mL相近，说明该模型拟合的有效性。

［1］ 赵朋超，王建华，权春善，等.枯草芽孢杆菌抗菌肽生物合成的研究进展［J］.中国生物工程杂志，2010，30（10）：108-113.

［2］ 张彩凤.生防菌枯草芽孢杆菌的研究进展［J］.现代农村科技，2015，（21）：47-47.

［3］甄静，郭直岳，谢宝恩，等.枯草芽孢杆菌XK-1产芽孢条件的优化［J］.中国农学通报，2012，28（27）：146-151.

［4］ 郭夏丽，狄源宁，王岩，等.枯草芽孢杆菌产芽孢条件的优化［J］.中国土壤与肥料，2012，（03）：99-103.

［5］ 孟利强，赵晓宇，陈静宇，等.响应面法优化枯草芽孢杆菌B91发酵培养基［J］.安徽农业科学，2015，（25）：26-29.

［6］ 陈琳，孟祥晨.响应面法优化植物乳杆菌代谢产细菌素的发酵条件［J］.食品科学，2011，32，（3）：176-180.

［7］ 王西祥，丁延芹，杜秉海，等.响应面法优化枯草芽孢杆菌NS178产芽孢发酵工艺［J］.山东农业科学，2015，（04）：59-65.

Optimization of spore production in fermentation conditions aboutBacillus subtilisB91

CHEN Jing-yu1，LI Jing1，2，ZHANG Shu-mei1，2，MENG Li-qiang1，2
（1.Heilongjiang Key Laboratory of Biotechnology，Institute of Microbiology of Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150010，China；2.Institute of Advanced Technology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150020，China）

Under the condition of cultivation in the flask，by using single-factor experiment，Bacillus subtilisB19's liquid medium volume，initial PH and fermentation temperature were optimized.On the basis of response surface analysis，the response-surface model was obtained and model fitting did well.The optimum spore production and fermentation conditions ofBacillus subtilisB19 were determined.Finally it finds out that liquid volume is 44.7 mL，initial PH is 8.3 and fermentation temperature is at 31.5℃.Under the condition of the optimal fermentation cultivation，spore concentration is 44.89billion±0.29 billion/mL，which is increased by 36.4%before optimization.

Bacillus subtilis；Spore；Response surface；Fermentation condition；Optimization

Q781

A

1674-8646（2016）12-0001-04

2016-05-17

黑龙江省科学学部委员指导专项（2014HK013）

陈静宇（1980-），男，黑龙江哈尔滨人，学士，实验师，从事农业微生物研究。

孟利强（1983-），男，内蒙古呼和浩特人，硕士，副研究员，从事农业微生物、分子生物学研究，e-mail：mengliqiang83420@163.com。