三种方法提取肠道腺病毒核酸的比较

潘　钰，杨明华，原　韬，于　冲，张靖坤，沈欣欣，夏海华（1.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150010；2.黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨 150020；.哈尔滨市儿童医院，哈尔滨 150010；.哈尔滨学院理学院生物系，哈尔滨 150001）

三种方法提取肠道腺病毒核酸的比较

潘钰1，2，杨明华3，原韬1，2，于冲1，2，张靖坤4，沈欣欣4，夏海华1，2
（1.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150010；2.黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨 150020；3.哈尔滨市儿童医院，哈尔滨 150010；4.哈尔滨学院理学院生物系，哈尔滨 150001）

采用传统的RNAiso法、以SiO2为吸附载体的二氧化硅吸附法及商品化吸附膜式柱提取试剂盒法三种方法提取阳性样本肠道腺病毒核酸，测定核酸浓度，进行实时荧光定量PCR，检验核酸提取对该反应影响，发现吸附膜式柱提取试剂盒法提取腺病毒核酸效果最佳。

腺病毒；核酸提取；荧光定量PCR

人类腺病毒（Adenovirus）为双链DNA病毒，大概35KB，它能引起一系列疾病，如急性呼吸道疾病、角膜结膜炎、肠胃炎［1］。它分为47个血清型和6个亚类（A 到F），近些年F亚类中的病毒型40和41被确认为肠道感染的病原体，是仅次于轮状病毒的引起小儿肠胃炎的主要病毒，肠道腺病毒的感染在全球范围内发生，4%～17%的小儿腹泻是由它引起的。AD-40和AD-41主要感染2岁以下的孩子且在全年发生。临床症状为水样腹泻伴有呕吐、低烧、轻度脱水［2，3］。AD-40是1岁左右的婴儿的感染源，AD-41则是一些大龄的幼儿的感染源［4］。

临床上快速准确地检测病原体对疾病的诊断起到关键的作用，研究表明金标法和荧光定量PCR方法都可用于检测肠道病毒，通常是2种或多种病毒一起检测，为方便操作，往往提取病毒的RNA，进而反转录成cDNA，进行荧光定量PCR检测的灵敏度较金标法更高些［5］。因此，提取到质量较高的病毒核酸为进一步进行实时荧光定量PCR反应监测病毒打下了良好的基础。笔者采取RNAiso法、二氧化硅法、商品化吸附膜式柱提取试剂盒法三种不同的方法提取腹泻小儿粪便中的腺病毒RNA，反转录后进行实时荧光定量PCR，通过分析Ct值以及提取的时间和成本来综合评价3种提取方法，选择对后续荧光定量PCR最有利的方法，为以后的腹泻病毒快速准确检测奠定基础。

1　材料与方法

1.1试验材料

实验室保存的腺病毒阳性样本。选取3个样本，每个样本设置3个重复。

1.2试验试剂

TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、二氧化硅、Tris-Hcl、EDTA、Trizol。

1.3试验主要仪器设备

Nanodrop 2000c，StepOne Real-Time PCR system。

1.4试验方法

1.4.1病毒核酸提取

1.4.1.1RNAiso法

按照TaKaRa试剂盒说明书进行。

1.4.1.2SiO2法

吸取10%的粪便样本100μL加入到1.5 PV管中，继续加入1 000μL的裂解缓冲液和40μL的分离硅溶液，涡流振荡10s，室温下静置10min后，离心30s，弃上清液。第一次洗涤：加入1 000μL洗涤缓冲液，充分振荡洗涤两次；第二次洗涤：加入1 000μL70%的乙醇，充分振荡洗涤两次；第三次洗涤：加入1 000μL丙酮，充分振荡洗涤两次。在56±2℃加热器上干燥10min（彻底干燥），将彻底干燥后的沉淀溶解于50μL的DEPC dH2O水中，用移液枪吹打溶解，在56±2℃加热器上温育10min，最大转速离心5min，将上清液（约45μL）转移到新的1.5 PV管中，在管壁上标记样本名称、编号、提取时间，-80℃下保存备用。

1.4.1.3吸附膜式柱提取试剂盒法提取法

参照 TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit使用说明书进行；实验步骤中的3、4、5、6提取DNA以及步骤12中DNaseⅠ消化的步骤省略不做。

1.4.2核酸浓度纯度检验

取核酸样品2μL，利用Nanodrop 2000c微量分光光度计检测其浓度及A260/A280、A260/A230的比值。

1.4.3反转录

按照试剂盒说明书进行反转录。

1.4.4实时荧光定量PCR检测

引物和探针，同时设定阳性对照和阴性对照。阳性对照，前期实验室检测确定为阳性的样本；阴性对照为配制PCR体系所用的去离子水。使用美国ABI公司StepOne Real-Time PCR system扩增仪，每管反应总体积为25μL，5μL的样品cDNA，20μLPCR扩增预混液，共45个循环。Ct值≤37且有对数增长曲线的为扩增阳性。

表1　三种方法提取腺病毒核酸的浓度Tab.1 Concentration of adenovirus nucleic acid which extracted by three methods

2　结果与分析

2.1核酸的均一性

纯的DNA样品 OD260/OD280应为 1.8～2.0，OD260/OD230应大于2.0，OD260/OD280小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子。

从核酸浓度看RNAiso法提取的腺病毒核酸浓度相对较高，且重复性较好，MiniBEST试剂盒提取的病毒核酸浓度低，二氧化硅法提取核酸主要的不足是重复性不好。

图1　三种方法提取腺病毒核酸的A260/A280平均值Fig.1 The A260/A280 average of adenovirus nucleic acid which extracted by three methods

三种提取方法获得的腺病毒核酸的A260/A280平均值分别为1.55、1.67、1.78。MiniBEST试剂盒提取的病毒核酸质量较好，从数值看还是有少量蛋白质污染。

2.2Ct值

图2　三种方法提取腺病毒核酸进行荧光定量PCR所得Ct值Fig.2 The Ct value of adenovirus nucleic acid which extracted by three methods detected by Real-Time Quantitative PCR

研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。图2分别为采取三种不同方法提取三个腺病毒核酸，每个样品三个重复，之后进行荧光定量PCR反应得到的Ct值；通过比较三种方法提取的核酸进行荧光定量PCR所获得的Ct值，结果显示采用MiniBEST试剂盒提取的核酸经过荧光定量PCR得到的Ct值最小，表明目的基因拷贝数最多，腺病毒含量最多。SiO2法提取的腺病毒核酸获得的Ct值稍高于试剂盒法。RNAiso法提取得到的核酸进行荧光定量PCR所得Ct值最大，表明目的基因含量最少。

3　讨论

近年来，实时荧光定量PCR技术由于具有较好的敏感性、特异性和可重复性，能实现多重反应，具有自动化程度高、无污染性、实时性和准确性的优势，在分子诊断领域发展最快，应用最成熟也最常被采用。肠道病毒中具有代表性的腺病毒、轮状病毒等引发腹泻的病毒是我们在临床诊断过程中比较常见的，在本研究中，三种方法的提取时间类似，费用MiniBEST试剂盒相对高些，二氧化硅价格较低，RNAiso试剂成本居中。通过对三种方法提取腺病毒核酸的结果分析，虽然使用RNAiso法提取的核酸总浓度很高，但是从后续实时荧光定量PRC扩增的结果看，这种方法灵敏度较低，提取的目的核酸较少；二氧化硅吸附法提取的核酸浓度不太稳定，重复性不好，荧光定量PCR所得Ct值较RNAiso法低，说明该法提取的目的核酸浓度比RNAiso高；使用MiniBEST试剂盒提取的核酸总浓度虽然低，但是经过荧光定量PCR扩增获得的Ct值最低，说明目的病毒核酸浓度最高，提取效率最高，因此使用该法提取腺病毒核酸效果最好，能更好地进行病毒的鉴定及定量。

［1］ Dorden S，Mahadevan P.Functional prediction of hypothetical proteins in human adenoviruses［J］.Bioinformation，2015，11（10）：466-473.

［2］ 李林，查巍，金载璇，等.腹泻患儿粪便中轮状病毒与肠道腺病毒检测结果分析［J］.临床输血与检验，2015，3（17）：212-214.

［3］ Uhnoo I，Svensson L，Wadell G，et.Enteric adenoviruses.［J］.Baillieres Clin Gastroenterol，1990，4（3）：627-642.

［4］ 王秀丽.肠道腺病毒感染引起小儿腹泻临床治疗与研究［J］.临床医药文献电子杂志，2014，1（6）：23-25.

［5］ 石利民，王璇，乔梦凯，等.病毒性腹泻病原检测方法比较研究［J］.现代预防医学，2014，41（23）：4342-4344.

Comparison of three methods for extracting enteric adenovirus nucleic acid

PAN Yu1，2，YANG Ming-hua3，YUAN Tao1，2，YU Chong1，2，ZHANG Jing-kun4，SHEN Xin-xin4，XIA Hai-hua1，2
（1.Institute of Microbiology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150010，China；2.Institute of Advanced Technology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150020，China；3.Harbin Children's Hospital，Harbin 150010，China；4.Harbin University Department of Biology，Faculty of Science，Harbin 150001，China）

Extracted nucleic acid of positive samples of enteric adenovirus using the traditional RNAiso method，SiO2as carrier adsorption silica adsorption method and adsorption film column extraction kit method.We measured the concentration of the nucleic acid and tested nucleic acid extraction efficiency by real-time fluorescence quantitative PCR.It was found that the membrane adsorption column extraction kit method extract adenovirus nucleic acid has the best effect.

Enteric adenovirus；Nucleic acid extraction；Real time PCR

R450

A

1674-8646（2016）12-0033-03

2016-05-23

省科学院青年基金（CX15BPYV03）；省院所基本应用技术研究专项（CZ14BXHH06）

潘钰（1987-），女，黑龙江哈尔滨人，硕士，实习研究员，主要从事应用医学微生物研究。

夏海华（1971-），女，辽宁清源人，硕士，研究员，主要从事应用医学微生物研究。