加味生脉补心丹对冠心病气虚血瘀证大鼠动脉粥样硬化的影响*

潘继兴邓文祥曾光△陈青扬吴华英李亮刘平安何军峰黄惠勇，3△（1．湖南省长沙市中医医院，长沙市第八医院，湖南长沙410100；.湖南中医药大学，湖南长沙41008；3.湖南中医药大学中医诊断学湖南省重点实验室，湖南长沙410007）

·证治探讨·

加味生脉补心丹对冠心病气虚血瘀证大鼠动脉粥样硬化的影响*

潘继兴1，2邓文祥2曾光2△陈青扬2吴华英2李亮2刘平安2何军峰2黄惠勇2，3△
（1．湖南省长沙市中医医院，长沙市第八医院，湖南长沙410100；2.湖南中医药大学，湖南长沙410208；3.湖南中医药大学中医诊断学湖南省重点实验室，湖南长沙410007）

目的制备模拟人类发病过程的大鼠冠心病模型，初步探讨加味生脉补心丹对动脉粥样硬化的影响及干预机制。方法将30只大鼠分为正常组、模型组、西药组、中药高、低剂量组，正常组予普通饲料喂养，其余组高糖高脂饲料喂养5周，第6周造模组采用腹腔3次注射垂体后叶素制备冠心病心肌缺血模型。中药高、低剂量组予加味补心丹药液2.25、0.75 g/mL剂量灌胃，西药组予单硝酸异山梨酯药液灌胃，连续18周。观察各组对空腹血糖、血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、脂联素、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、C反应蛋白（CRP）、心肌病理切片和主动脉弓切片结果的影响。结果1）与正常组比较，模型组的TG、TC、LDL-C、脂联素水平降低，HDL-C、IL-6、TNF-α、CRP、FBG升高。2）与模型组比较，中药组和西药组的动脉粥样硬化程度降低，斑块程度下降；中药组和西药组的心肌纤维化程度降低，心肌受损程度下降。中药组和西药组的外在表现均优于模型组；中药组和西药组TG、TC、LDL-C的值降低，HDL-C的值升高；脂联素水平升高，IL-6、TNF-α、CRP降低。结论加味生脉补心丹组可以降低冠心病大鼠的血糖、血脂，抗动脉粥样硬化及抗心肌纤维化，机制可能与改善脂联素水平和改善炎症反应有关。

加味生脉补心丹中药冠心病心肌缺血动脉粥样硬化

【Abstract】Objective：To prepare coronary heart disease（CHD）in ratsmodel similar to human disease process，and observe the effect of Jiawei shengmaibuxin Decoction on atherosclerosis，and discuss its intervention mechanism.M ethods：After ordinary adaptive feed for 1 w，30 ratswere divided into the normal group（n=6），themodel group（n=6），western medicine group（n=6），high-dose group（n=6），low-dose group（n=6）.The ordinary groupswere normally fed，while the restwere fed with high sugar and high fat feed for 5 w.In 6th week，modules weremade with 10%chloral hydrate with intraperitoneal injection of 0.3 g/kg，supine position fixed in rats after anesthesia on stage，connecting physiological recorder，recording a standardⅡlead electrocardiogram of rats.later，themodel group received injection of pituitrin 6 U/kg（1 concentration for 2 U/m）with 5 s constant speed；the normal group received normal amount of saline injection，3 times，each time interval of 15 days.According to the following methods，the indicators were observed.After validation of coronary heart disease，myocardial ischemia modelwas established；they continued being fed with high sugar and high fat feed for 18 weeks.The effects of Jiawei Jiawei shengmai buxin Decoction on fasting blood glucose，serum total cholesterol，triglyceride，low density lipoprotein cholesterol（LDL-C），high-density lipoprotein cholesterol（HDL-C），adiponectin，TNF，IL-6，CRPwereobserved，as well as the results ofmyocardial pathologic biopsy and the aortic arch.Results：1）Compared with the normal group，in the model group，TG，TC，LDLC，and adiponectin level reduced，and HDLC，IL-6，TNF-α，CRP and FBG rose.2）Compared with the model group，in traditional Chinese medicine and western medicine groups the extent of atherosclerosis reduce，as well as plaque，myocardial fibrosis degree，myocardial damage.The outward sign of traditional Chinese medicine group and western medicine groups were better than those of the model group；in Traditional Chinesemedicine and western medicine groups，TG，TC，and LDLC value reduced，as well as IL-6，TNF-α，CRP；HDLC value increased，as well as Adiponectin levels.Conclusion：Jiawei shengmai buxin Decoction can reduce the blood sugar，blood fat of coronary heart disease（CHD）in rats，with resistance against atherosclerosis and myocardial fibrosis，whose mechanism may be related to improving the level of adiponectin and the improvementof the inflammatory response.

【Key words】Jiawei shengmai buxin Decoction；Traditional Chinesemedicine（TCM）；Coronary heart disease；Myocardial ischemia；Atherosclerosis

当前，冠心病成为患者致死、致残的主要因素，寻求有效的防治方法是全球医疗面临的挑战性工作［1］。中医药治疗此病历史悠久，积累了很多有效的经验方，中医药对其治疗和防治具有良好的效果。加味生脉补心丹是湖南中医药大学第一附属医院应用10余年的经验方，具有良好的治疗效果，临床研究表明加味生脉补心丹防治冠心病有潜在优势［2］。本实验研究观察此方对冠心病大鼠动脉粥样硬化的影响，并初步探讨其作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物30只SPF级SD雄性大鼠，体质量140～160 g，平均（150±10）g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXX（湘）2011-0003。饲养于湖南中医药大学实验动物中心SPF实验室，室温（20±3）℃，相对湿度55%～70%，自由饮水，分笼饲养。普通饲料：实验鼠全价饲料，由湖南中医药大学实验动物中心制作提供（玉米粉53%、豆饼粉24%、麦麸16%、鱼粉5%、骨粉1%、食盐1%，其他营养添加剂均按产品说明添加）。高脂饲料（D12492 Rodent Dietwith 60 kcal%Fat）购于美国Research Diet公司。所有饲料均进行高温消毒与辐射照射处理。

1.2试剂与药物总胆固醇（TC）测定试剂盒，甘油三酯（TG）测定试剂盒，低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）测定试剂盒，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）测定试剂盒，糖化血清蛋白测定试剂盒，葡萄糖（Glu）测试盒，脂联素（ADP）测试盒，胰C反应蛋白（CRP）测试盒，均由南京建成公司提供。Rat IL-6 ELISA kit（欣博盛，批号ERC003.96），Rat TNF-αELISA kit（批号ERC102a. 96）。单硝酸异山梨酯（鲁南贝特制药有限公司，批号29150653）10mg，溶于生理盐水，按10mg/（kg·d）予大鼠灌胃，备用。垂体后叶素注射液pit（6 U/mL，南京新百药有限公司，批号111204）。加味生脉补心丹，药物组成：生地黄、人参、茯苓、柏子仁、五味子、天花粉、丹参、枳实、水蛭、檀香、荷叶、炙甘草等，药物均购自湖南中医药大学第一附属医院，按成年人60 kg体质量剂量加水煎煮2次，合并煎液，分别离心过滤，浓缩至含生药0.75 g/mL（低剂量组）、2.25 g/mL（高剂量组），分别离心过滤，高压灭菌后于4℃冰箱保存备用。

1.3模型制备参考文献［1，3］，普通适应性喂养1周后将30只大鼠分为正常组6只和造模组24只，高糖高脂饲料喂养5周。第6周造模组大鼠用10%水合氯醛0.3 g/kg腹腔注射，麻醉后仰卧位固定于鼠台上，连接生理记录仪，记录大鼠标准Ⅱ导联心电图。准备完毕后，模型组注入垂体后叶素6 U/kg（浓度为2 U/mL），5 s恒速注射完毕，正常组注射等量生理盐水，在造模后30min按照下述方法观测各项指标。1）体温：将电子体温计插入大鼠肛门约2 cm处，直到电子体温计数值稳定，读取屏幕数据。2）心电图指标：记录造模后30min内标准Ⅱ导联心电图，以QRS波群的终点与ST段交接处的J点位移判断心肌缺血发生与否，并以PR段为基线记录J点位移，以J点上升或下降I＞0.1mV视为发生心肌缺血心绞痛，同时记录大鼠心率变化。若大鼠出现以下症状为造模成功。1）体征：正常组大鼠唇周、爪子、耳壳、尾巴颜色淡红，温度正常，大便成形；模型组大鼠唇周、爪子颜色紫暗，爪温下降，耳壳、尾巴变白发凉，大便湿烂。2）体温：造模前，与正常组体温（36.28±0.52）℃比较，模型组大鼠体温（36.27±0.62）℃，差异无统计学意义（P＞0.05）。造模后，正常组（36.32±0.48）℃，模型组（35.24±0.58）℃，两组体温差异有统计学意义（P＜0.05）。3）心电图：与正常组比较，模型组大鼠J点在造模前差异无统计学意义（P＞0.05），在造模后J点位移显著增加（P＜0.05）。模型组大鼠造模后心率减慢。

1.4分组及给药造模成功后，将24只造模成功的大鼠随机分为4组，即模型组、中药低剂量组、中药高剂量组、西药组，每组6只。各组大鼠予以高糖高脂饲料喂养，普通组予以普通饲料喂养。正常组、模型组予2 mL生理盐水灌胃，中药各剂量组予2mL相应剂量灌胃，西药组予按10 mg/（kg·d）予单硝酸异山梨酯灌胃［3，6-7］，每日灌胃1次，连续18周。

1.5标本采集与检测第18周末各组大鼠行ECG，记录心电图结果。腹主动脉取血：灌胃18周结束后，大鼠隔夜禁食12 h，腹腔取血，离心取血清，放免法检测血脂、血清脂联素、甲状腺素，酶联免疫吸附法（ELISA）检测CRP-s、IL-6、TNF-α；取血浆，全自动血液流变仪检测全血黏度、血浆黏度、红细胞压积；检测空腹血糖（FBG）。第19周处死各组大鼠，截取心脏，置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋。HE染色后，光镜观察。截取主动脉弓，一部分置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋。HE染色后，光镜观察，用于主动脉斑块检测。观察各组大鼠体质量、进食量、饮水量、尿量、毛发变化情况、活动及精神状态、垫料潮湿情况、大便等指标。

1.6统计学处理应用SPSS20.0统计软件处理。计量资料以（±s）表示，多组间两两比较采用单因素方差分析法，方差齐采用LSD检验，方差不齐则用，Dunnett’s T3检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1外观特征注射垂体后叶素后，与正常组相比，模型组大鼠活动明显减少，心率、呼吸加快、皮肤、嘴唇颜色变白。随着灌胃时间的累积，中药组和西药组的一般状况逐渐改善。

2.2各组大鼠糖、脂代谢指标比较见表1。1）糖代谢指标：与正常组比较，各组大鼠FBG均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗完成时，与模型组比较，各给药组FBG均有不同程度的下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。2）脂代谢指标：模型组的TG、TC、LDL-C水平较正常组明显增高，说明模型组有明显脂代谢紊乱。与模型组比较，西药组TC、TG、LDL-C含量明显降低（P＜0.05），各中药组的TC、TG、LDL-C含量也较模型组出现不同程度的降低（P＜0.05），说明西药组和中药高、低剂量组都能纠正脂代谢紊乱。而各组在HDLC方面比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1　各组大鼠糖、脂代谢指标比较（mmo l/L，±s）

表1　各组大鼠糖、脂代谢指标比较（mmo l/L，±s）

与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同。

组别n正常组6模型组6西药组6 TC TG HDL-C 1.47±0.18 0.81±0.31 1.41±0.29 2.91±1.43*3.94±1.69*0.99±0.24 1.78±0.22*△2.01±0.12*△1.36±0.26*△LDL-C FBG 0.31±0.52 12.38±3.76 0.39±0.23*29.87±1.39*0.31±0.11*△13.21±11.22*△中药高剂量组6 1.47±0.18*△1.55±1.03*△1.25±0.20*△0.34±0.07*△17.85±10.48*△中药低剂量组6 2.13±0.17*△2.27±0.43*△0.88±0.34*△0.37±0.03*△23.15±5.94*△

2.3各组脂联素、IL-6、TNF-α、CPR比较见表2。与模型组比较，中药组和西药组脂联素水平升高，IL-6、TNF-α、CRP水平降低（P＜0.05），说明西药组和中药高、低剂量组都能升高脂联素水平，可降低炎症反应IL-6、TNF-α、CRP水平。

表2　各组大鼠脂联素、I L-6、TNF-α、CRP水平比较（±s）

表2　各组大鼠脂联素、I L-6、TNF-α、CRP水平比较（±s）

组别n正常组6模型组6西药组6脂联素（mg/mL）IL-6（mg/mL）TNF-α（pg/mL）3.46±0.65 52.51±6.89 14.80±10.81 3.11±0.33*68.86±9.83*31.97±0.53*5.25±0.46*△57.52±9.26*△25.42±4.59*△CRP（mg/mL）0.91±0.57 1.91±0.57*1.57±0.45*△中药高剂量组6 5.90±0.76*△62.38±8.43*△24.57±4.73*△1.51±0.59*△中药低剂量组6 3.96±0.36*△65.58±7.33*△29.10±4.23*△1.82±0.42*△

2.4各组主动脉弓病理切片HE染色结果见图1。模型组出现粥样硬化斑块，有脂肪浸润，有空泡细胞，有血栓形成，正常组、中药组和西药高、低剂量组不明显。

图1　各组主动脉弓病理切片果（HE染色，4 0 0倍）

2.5各组心肌病理切片HE染色结果见图2。正常组心肌细胞均匀、纤细，心肌纤维排列整齐，细胞核清晰可见。与正常组比较，模型组的心肌纤维粗大，排列紊乱，甚至有纤维断裂现象，心肌细胞肥大，细胞核边缘不清，心肌细胞排列紊乱；西药组细胞体积有不同程度的缩小，心肌细胞排列规则，断裂现象少见，细胞核大小均匀；中药高剂量组细胞体积有不同程度的缩小，心肌细胞排列规则，断裂现象少见，细胞核大小均匀；中药低剂量组细胞体积有不同程度的缩小，心肌细胞排列规则，断裂现象少见，细胞核大小均匀。

图2　各组心肌组织切片（HE染色，2 0 0倍）

3　讨论

大鼠的冠心病模型较困难，但动物来源、饲养条件要求不是很高，李同达等［8］有采用Wistar大鼠高糖高脂喂养加上每月腹腔注射维生素D31次，诱导冠心病大鼠模型。有单次腹腔注射垂体后叶素诱导急性心肌缺血模型，但缺乏稳定性［3，9］。有手术冠状动脉结扎法致急性心肌梗死模型，但死亡率很高，不便于中药的干预研究［10］。笔者在多次预实验的基础上，发现通过采用高糖高脂膳食喂养5周后，采用腹腔3次注射垂体后叶素，导致多次持续复制冠心病心肌缺血模型，在此基础上，高糖高脂喂养诱导高脂血症，终致冠状动脉粥样硬化，在冠心病模型基础上再继续高糖高脂喂养18周，冠心病大鼠明显表现有尾巴、嘴唇、耳尖颜色变白，血脂紊乱、心肌损伤、心肌纤维化、联素水平降低、IL-6、TNF-α、CRP升高，论证冠心病心肌缺血的模型成立。造模成功后，冠心病大鼠有少食、便溏及少动懒动、精神萎靡的表现，符合中医“气虚证”的表现［11-12］；大鼠形体肥胖，舌质紫黯，高血糖、高血脂、低脂联素水平，其舌色、爪色比正常组大鼠要深，呈淡紫色，心肌纤维化，符合中医“瘀证”的表现［13-15］。从中医的角度推之，造模成功后，大鼠的病理因素有痰和瘀，证明冠心病心肌缺血模型气虚痰瘀证成立。造模成功后，予以经验方加味生脉补心丹干预，旨在挖掘中药方药的可能作用机制。

研究中与正常组比较，模型组的TG、TC、LDLC、脂联素水平降低，HDL-C、IL-6、TNF-α、CRP、FBG升高。与模型组比较，中药组和西药组的动脉粥样硬化程度降低，斑块程度下降；中药组和西药组的心肌纤维化程度降低，心肌受损程度下降。中药组和西药组的外在表现均优于模型组；中药组和西药组TG、TC、LDLC的值降低，HDL-C的值升高；脂联素水平升高，IL-6、TNF-α、CRP降低。说明加味生脉补心丹和西药组均有降血脂、血糖，改善心肌纤维化，减轻心肌受损程度作用。加味生脉补心丹由生地黄、人参、茯苓、麦冬、柏子仁、五味子、天花粉、丹参、枳实等中药组成。本方心脾肾同治，阴阳兼顾，共奏滋阴清热、补脾益气、活血化瘀之功效。加味生脉补心丹组能够有效地改善冠心病心肌缺血，机制可能为通过降低冠心病大鼠的血糖、血脂及改善脂联素水平和改善炎症反应，起到抗促进循环、保护心肌作用。

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Effect of Jiawei Shengmai Buxin Decoction on Coronary Atherosclerosis in Rats with Qi Deficiency and Blood Stasis

PAN Jixing，DENG Wenxiang，ZENG Guang，et al.Changsha Hospital of Traditional Chinese Medicine（Changsha Eighth Hospital），Hunan，Changsha 410208，China.

R285.5文献标志码：A

1004-745X（2016）07-1303-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.07.012

国家自然科学基金面上项目（81373551）；教育部博士点博士导师课题（20134323110001）；湖南省科技厅社会发展支撑计划重点项目（2014S2032）；湖南省中医药科研计划项目（2014153）；湖南省研究生创新课题（CX2015B332）；湖南中医药大学中医诊断学国家重点学科开放项目（2013ZYZD04，2014-5，2014-28，2015ZYZD32）；湖南省学位与研究教育教学改革研究课题（JG2015B068）
△

（电子邮箱：zengguang033@126.com）

2016-03-16）