GIV诺如病毒荧光定量一步RT-PCR方法的建立

敖元云 虞结梅 周冬梅 靳淼 李莉莉 段招军

100052北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所腹泻室

GIV诺如病毒荧光定量一步RT-PCR方法的建立

敖元云 虞结梅 周冬梅 靳淼 李莉莉 段招军

100052北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所腹泻室

目的 建立灵敏、特异的GIV诺如病毒的荧光定量检测方法。方法 合成针对GIV诺如病毒的特异性引物以及Taqman探针，优化反应体系及条件，根据我国新发人GIV诺如病毒序列（GenBank序列号：KC894731）构建荧光定量检测的RNA标准品，对其灵敏度、特异性、重复性进行评估，以传统逆转录-聚合酶链反应（Reverse transcription-po1ymerase chain reaction，RT-PCR）的方法作为参考评价。结果 该方法检测的灵敏度可以达到1.0×102拷贝/μ1，检测范围为102～108拷贝/ μ1；与GI、GII诺如病毒、肠道腺病毒、轮状病毒、星状病毒等无交叉反应；批内和批间重复性实验的循环阈值（Ct）变异系数（CV）分别小于1.31%和3.68%；在阳性粪便标本的对比检测中发现，该方法与普通RT-PCR相比具有灵敏度高、能够定量的优势。结论 本研究建立的检测GIV诺如病毒的荧光定量一步RT-PCR法，可应用于GIV诺如病毒的检测。

【主题词】 诺如病毒；GIV；荧光定量

诺如病毒（Norovirus，NoV）是单股正链、无包膜的RNA病毒，属于杯状病毒科诺如病毒属，是引起全世界所有人群非细菌性胃肠炎的主要病原体之一［1］。根据诺如病毒衣壳区的核苷酸序列，将NoV分为5个基因组（genogroup，G），GI-GV，感染人的包括GI、GII和GIV，而GIII和GV分别感染牛和鼠。GIV进一步分为两个基因型，感染人的GIV.1型和感染动物的GIV.2型［2］。GI和GII是诺如病毒引起胃肠炎暴发最常见的两个遗传组［3-4］，而GIV引起暴发的报道却是很少见，我国目前未见有关GIV NoVs报道。本实验室利用454高通量测序技术首次在我国河北省卢龙县发现人GIV.1 NoV毒株［5］，以此临床样本为基础，建立了灵敏、快速、特异性的GIV诺如病毒荧光定量PCR检测方法。

1 材料与方法

1.1病毒标本与处理 本实验中GIV NoV阳性毒株（GenBank登录号为KC894731）是通过454高通量测序发现，来源于河北省卢龙地区2011年7月的儿童腹泻粪便标本。采用处理液 PBS对其制成10%便悬液，保存于-20℃。

1.2试剂与仪器 核酸提取试剂盒Vira1 Nuc1eic Acid Extraction Kit II购自Geneaid公司；SuperScript III Reverse Transcriptase购自 Invitrogen公司；2× Power Taq PCR Master Mix kit购自北京百泰克生物技术有限公司；体外转录试剂盒MEGA script T7 Kit和转录物纯化试剂盒MEGA c1ear Kit购自ABI公司；限制性内切酶及相应Buffer购自Promega公司；荧光定量RT-PCR试剂盒Quanti Tect Probe RT-PCR Kit购自Qiagen公司。仪器ABI7500荧光定量PCR仪为ABI公司产品。

1.3分析软件 Primer Premier5、DNA MAN6.0、DNAStar software package、Lasergene8、和MEGA 5.0等。

1.4引物和探针 此方法所使用的引物及探针序列，基于ORF1/ORF2重叠区，此区域是GIV NoVs株序列中高度保守区［6］。

1.5核酸提取 采用Vira1 Nuc1eic Acid Extract Kit II从便悬液中提取核酸，方法见说明书。

1.6标准品制备 以本实验室GIV毒株KC894731序列为基础，人工合成127 bp的核苷酸序列作为荧光定量一步 RT-PCR的标准品（表 1），由北京Tsingke公司完成。此序列与GenBank GIV参考株同源性接近99%。

将合成的核苷酸序列克隆入PGEM-Teasy载体中，位于载体T7启动子之后。将此重组体转化进入E.co1i DH5a感受态细胞扩增，然后用质粒提取试剂盒（High-Speed P1asmid Mini Kit）提取质粒。用PVUII单酶双切后，电泳并切割600 bp片段左右的凝胶带，按照凝胶回收试剂盒（QIAquick Ge1 Extraction Kit）方法操作回收、纯化产物，测序以验证序列正确性。用体外转录试剂盒（MEGA script T7 Kit）对纯化线性质粒进行体外转录，然后按照转录产物纯化试剂盒（MEGA c1ear Kit）方法进行纯化。在260 nm处，用分光光度仪对其定量，使用无核酸酶水稀释至1010拷贝/μ1，以作为荧光定量检测的标准品，保存于-70℃。

1.7荧光定量一步RT-PCR法 使用Qiagen公司的Quanti Tect Probe RT-PCR Kit，一步法RT-PCR反应实验参照试剂盒说书进行。反应的总体积为25 μ1，体系组分为：2×Quanti Tect Probe RT-PCR Master Mix 12.5 μ1；Quanti Tect RT Mix 0.25 μ1；Mon4F（10 μmo1/L）、Mon4R（10 μmo1/L）各1 μ1；探针Ring4（10 μ1/L）0.5 μ1；RNAse-FREE水7.25 μ1；Temp1ate RNA 2.5 μ1。反应条件为：50℃ 30 min；95℃15 min；94℃ 15 s，60℃60 s（共45个循环）；在60℃收集荧光信号。

1.8荧光定量一步RT-PCR法灵敏度实验 将已知拷贝数的标准品进行10倍梯度稀释（108-101拷贝/u1），对它们进行荧光定量一步RT-PCR法检测，以检测其检出范围和最低检测限。

1.9荧光定量一步RT-PCR法特异性实验 利用建立起的荧光定量一步RT-PCR法，对GIV、GI和GII NoVs的RNA标准品，以及轮状病毒、肠道腺病毒、星状病毒等腹泻相关病毒核酸进行检测，验证其特异性。

1.10荧光定量一步RT-PCR法重复性实验 选取107～105拷贝/μ1范围的GIV NoV RNA标准品，进行荧光定量一步RT-PCR法检测，利用同一批体系对每个稀释度同时进行5次平行检测，作为批内重复试验，计算各稀释度Ct值的平均值和变异系数，以评价反应体系的稳定性。并选取107～105拷贝/μ1范围的GIV NoV RNA标准品，在同一周内选取3 d各配置体系分别对每个稀释度进行检测，作为批间重复试验，计算每次实验中Ct值的平均值和变异系数，以检验此种方法的重复性。

1.11荧光定量一步RT-PCR法对GIV阳性标本的检测 利用建立的荧光定量一步RT-PCR法体系，对实验室已有两份GIV阳性粪便标本进行检测，并按照La Rosa［7］等报道的方法，进行传统PTPCR方法对现有GIV阳性标本的检验，以验证此荧光定量一步RT-PCR法的效果。

2 结果

2.1标准曲线的建立 GIV NoV的检测结果在108～102拷贝/μ1范围内有极好的线性关系（图1A）。以RNA拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线，得到GIV NoV的标准曲线方程为：Ct=37.29 -3.447×1og（X），r=0.998，扩增效率为95.025%（图1B）。

A：From 1eft to right is：108-102copies/μ1. B：From 1eft to right is：102-108copies/μ1图1　GIV型诺如病毒标准品的扩增曲线Fig.1 PCR amp1ification and standard curve of GIV NoV standard

表1　荧光定量一步RT-PCR法检测GIV诺如病毒的批内和批间重复性Tab.1 Intra and Inter—assay coefficients of variation of the f1uorescent quantitative one-step RT-PCR to detect GIV NoVs

2.2荧光定量一步RT-PCR法的特异性 除GIV NoV能出现特异性荧光扩增曲线以外，其他病毒和阴性对照均没有扩增曲线产生。

2.3荧光定量一步RT-PCR法的重复性 批内重复试验结果显示，GIV NoV每个稀释度RNA的5个平行反应管Ct值的变异系数均在1.31%以下（表1）。批间重复试验结果显示，GIV NoV每个稀释度RNA在三次试验中Ct值的变异系数均在3.68%以下（表1）。由此证明此方法对GIV NoV检测的批内和批间重复性良好。

2.4荧光定量一步RT-PCR法对GIV阳性标本的检测 利用建立的荧光定量一步RT-PCR法体系，对现有的两份GIV阳性粪便标本检测，结果与应用传统RT-PCR方法［5］的检测结果一致。并且，应用传统PCR的方法，阳性结果往往是在第二轮PCR后才可以通过凝胶电泳成像出来，所以，相比来说荧光定量一步RT-PCR方法要更为省时、省力，并能够准确得到定量结果。

3 讨论

诺如病毒是引起儿童和成人非细菌性胃肠炎的最主要病原体，诺如病毒主要通过污染的食物和水源传播，也可通过人-人接触进行传播，经常在医院、学校等场所发生急性病毒性性胃肠炎暴发，因此对病毒的快速诊断，对临床诊断和疾病防控工作具有重要的意义。

全球中有近62%～80%诺如病毒暴发是由GII.4引起［8-9］，相反，关于GIV NoVs暴发报道却是很少，其通常是在散发病例和环境中被检测出［7，10，11］。至今，GIV NoVs在全球中整体流行情况以及来源还是未知的。不像GI和GII NoVs有成千上万个有效序列，GIV NoVs在基因库中却只有不到70个不完整的序列。目前，已经发表的GIV毒株全基因组序列只有三个，包括在美国涉及暴发的猫GIV.2 NoV［12］、在澳大利亚［13］和我国发现人GIV.1 NoVs［5］。其检测率的低下和基因序列的缺乏，可能反应出缺乏特异、灵敏的检测方法。

目前对GIV NoVs检测最主要的方法是传统的RT-PCR方法，但是传统RT-PCR法易发生交叉污染，并且需要两次PCR耗时费力。所以，我们希望能够建立灵敏、快速、特异的GIV诺如病毒荧光定量PCR检测方法，应用于临床标本的检测，以了解其流行率和病毒载量，希望能够增加对GIV NoVs的了解，从而对GIV NoVs疾病防控工作具有重要的意义。

本研究所用的引物与探针来自于Truji11o等［6］文章，对GIV NoVs有很好的检测特异性，与轮状病毒、GI和GII诺如病毒、肠道腺病毒、星状病毒等均无交叉反应。重复性试验表明此检测体系重复性良好。其在102拷贝水平能够稳定检测出GIV NoV，与Truji11o等［6］的文章中所报道检测限结果105拷贝水平比较，其灵敏度大大提高，可能与其利用粪便标本提取的核酸RNA做标准品有关，因粪便中的核酸酶和其他RT/PCR抑制剂的存在可以降低其对GIV NoV检测敏感性。建立的荧光定量一步RTPCR法与传统PCR方法的检测结果比较，证实其能够检测出已知的阳性病毒标本，并且与之相比更为快速简便，且能够精确定量。目前国内Yong Yan等［14］报道建立的检测GIV NoV荧光定量PCR方法，没有应用于阳性标本的评价，也还没有检出GIV NoV的报道，所以本研究填补了应用一步RT-PCR在我国腹泻病人粪便标本对GIV NoV检测的空白，具有较好实践意义。但本研究不足之处是，因GIV NoV检测率依然很低，没有进行大批量的阳性临床标本的评价应用。

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Development of fluorescent quantitative one step RT-PCR method for the detection of GIV norovirus

Ao Yuanyun，Yu Jiemei，Zhou Dongmei，Jin Miao，Li Lili，Duan Zhaojun Diarrhea Department，National Institute for Viral Disease Control and Prevention，Chinese Centre for Disease Control and Prevention，Beijing 100052，China

Duan Zhaojun，Email：zhaojund@126.com

Objective To estab1ish a f1uorescent quantitative one step rea1 time-PCR method for the detection of GIV NoVs.Methods Specific primers and TaqMan probe of GIV NoVs were ana1ysed and synthesized.Then the reaction system and conditions were optimized and the RNA standard was conducted according to the sequence of human GIV NoVs of our nation.The sensitivity，specificity，and repeatabi1ity of this method were eva1uated，and the traditiona1 RT-PCR method was used to assess the method.Results The sensitivity of this method reached 1.0×102copies/μ1，and the detection range was 102～108copies/μ1. No cross reaction with NoVs（GI，GII），enteric adenovirus，rotavirus，astrovirus and others was found，showing high specificity.By repeated experiments，the intra-assay and inter-assay coefficient of variation （CV）about Ct va1ue was 1ess than 1.31%and 3.68%respective1y，which showed good repeatabi1ity.The method has high sensitivity and accurate quantity advantage by comparison with the traditiona1 RT-PCR on detection of positive samp1es.Conslusions The deve1oped f1uorescent quantitative one step rea1 time PCR method for identification of the GIV NoVs wi11 be app1ied to detecting GIV NoVs in gastroenteritis patients.

norovirus；GIV；f1uorescent quantity

段招军，Emai1：zhaojund@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.024

2016-01-06）