ADAM10处理增强铜离子诱导的重组朊蛋白的蛋白酶抗性

陈操 吕燕 石琦 董小平

102206北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所朊病毒室传染病预防控制国家重点实验室

论 著

ADAM10处理增强铜离子诱导的重组朊蛋白的蛋白酶抗性

陈操 吕燕 石琦 董小平

102206北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所朊病毒室传染病预防控制国家重点实验室

目的 分析ADAM10对铜离子诱导后的PrP蛋白的剪切特点。方法 常规方法表达、纯化人PrP全长蛋白（aa 23-230），利用氯化铜对纯化后的 PrP蛋白进行诱导。用不同浓度的ADAM10对PrP蛋白进行处理，检测诱导后全长蛋白及剪切片段的PK抗性。结果 重组人PrP蛋白经Cu2+诱导后具有部分抵抗PK消化的特点。Cu2+诱导后的PrP蛋白可被ADAM10剪切，具有剂量依赖性。ADAM10对Cu2+诱导的PrP蛋白处理后抵抗PK消化的能力明显加强。结论 ADAM10可以剪切Cu2+诱导的PrP蛋白，同时增加了处理后PrP蛋白的PK抗性。

【主题词】 朊蛋白；铜离子；去整合素金属蛋白酶10；蛋白酶抗性；剪切

Fund programs：Nationa1 Natura1 Science Foundation of China（81401670，81572048，81301429）；SKLID Deve1opment Grant（2012SKLID102，2015SKLID503）

传播性海绵状脑病（transmissib1e spongiform encepha1opathies，TSEs）是一类可以感染人类和动物的神经退行性疾病［1］。目前研究认为，TSEs病原是一种异常形式的朊蛋白—朊病毒，故该病又称为朊病毒病（prion disease）。该类疾病的发病机制目前认为是正常的细胞型朊蛋白（PrPC）转变为空间构型异常的、不溶的及具有部分蛋白酶抗性的异常朊蛋白（PrPSc），它能够在受感染的脑组织中沉积，引起神经元的退行性变，最终导致患者死亡［2］。成熟的PrPC是一种通过其 C端的糖基磷脂酰肌醇（g1ycosy1phosphatidy1inosito1，GPI）锚定于细胞膜外表面的糖蛋白［3］。

近些年对该病的研究发现，二价金属离子如铜离子、锰离子及锌离子参与到了PrPC向PrPSc的转化过程中。在朊病毒感染小鼠的脑组织中这些二价金属离子的含量发生了明显的变化［4］。同时，二价金属离子可与重组野生型朊蛋白的八肽重复区结合，使重组野生型朊蛋白空间结构发生变化，具有部分抵抗蛋白酶K（Proteinase K，PK）消化的特点［5］。

我们之前的研究发现，PrP蛋白与去整合素金属蛋白酶10（A disintegrin and meta11oproteinase 10，ADAM10）可发生明显的相互作用并可以被其剪切。在朊病毒感染过程中，ADAM10的含量亦发生了明显的变化［6］。由于PrP蛋白是一种重要的铜离子代谢的转运蛋白［5］，结合铜离子后的PrP蛋白是否也能够经历ADAM10的剪切作用。本研究拟通过体外模拟铜离子结合后的PrP蛋白观察其是否能够被ADAM10剪切及对其剪切特点进行分析。

1 材料与方法

1.1材料 原核BL21（DE3）菌株、含有5个八肽重复区的重组人PrP蛋白表达质粒pQE30-huPrP23-230及GST蛋白表达质粒pQE30-GST均由本科室保存。

1.2野生型 PrP重组蛋白的表达与纯化 将pQE30-huPrP23-230转化至原核BL21（DE3）菌株，IPTG诱导表达，菌液超声破碎后与镍柱结合进行亲和层析纯化，透析后收集重组人PrP蛋白。

1.3铜离子处理 纯化后的野生型重组PrP蛋白经4℃、20 000 g离心30 min，上清与氯化铜（200 μmo1/L）4℃孵育2周后立即进行后续试验。

1.4蛋白酶抗性实验 纯化后的野生型重组PrP蛋白与2～160 μg/m1 PK 37℃孵育1 h。加入5× SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸5 min终止PK消化反应。用PrP抗体（3F4）特异性Western B1ot进行检测和分析［7］。为了避免铜离子对PK活性的影响，我们利用相同体积的纯化后的GST蛋白做对照，37℃直接与 PK孵育1 h，随后立即用 GST抗体（anti-GST）特异性Western B1ot进行检测和分析。

1.5PrP 体外剪切实验 根据说明书的要求，利用商品化的具有剪切活性的ADAM10蛋白（PF124，Merck公司）在37℃、1 h的条件下对纯化后的重组人PrP蛋白进行剪切试验。

2 结果

2.1Cu2+诱导后重组人PrP蛋白的PK消化特点

常规方法纯化重组人野生型PrP蛋白，经SDSPAGE检测，纯度＞95%，浓度为1 mg/m1。为了评估Cu2+对野生型PrP蛋白PK消化特性的影响，将Cu2+诱导后的野生型PrP蛋白与不同浓度的PK孵育，同时以没有Cu2+处理的PrP蛋白作为对照进行平行试验。Western B1ot结果显示经2.5 μg/m1的PK消化后对照组就检测不到PrP特异性条带的存在，然而在较高（5 μg/m1）的PK浓度条件下Cu2+诱导后的PrP蛋白仍可以检测到明显的PrP特异性信号。随着将PK浓度由5 μg/m1逐渐增加至40 μg/ m1时，PrP特异性信号强度则逐渐降低（图1A）。作为对照，Cu2+诱导后的GST蛋白在经2.5 μg/m1的PK消化后就检测不到GST特异性条带的存在（图1B）。表明Cu2+诱导后的PrP蛋白具有部分抵抗PK消化的特点。

图1　Cu2+诱导后PrP蛋白的PK消化试验Fig.1 Assays of PK-resistances of Cu2+-induced PrP

2.2ADAM10对Cu2+诱导后的重组人PrP蛋白的剪切作用 我们近期研究显示体外ADAM10可以特异性剪切重组人 PrP蛋白（未经任何处理）［6］，为了验证Cu2+诱导后的PrP蛋白是否也可以被ADAM10进一步剪切，我们将Cu2+诱导后的PrP蛋白与不同浓度的具有剪切活性的ADAM10蛋白进行孵育，Western B1ot结果显示未经ADAM10处理的全长PrP蛋白为一条单一的、具有特异性信号的条带，而经0.4 μg/m1 ADAM10处理后除了全长PrP蛋白外，在17 KDa左右看到PrP特异性的信号，同时随着将ADAM10浓度由0.4 μg/m1逐渐提升至6.4 μg/m1，17KDa左右PrP特异性的信号逐渐增强（图2A）。灰度值量化结果更加明显的显示经3.2 μg/m1 ADAM10处理后小片段的PrP蛋白占全长PrP蛋白的比例明显上升，至6.4 μg/m1 ADAM10处理时，小片段的PrP蛋白的灰度值是全长PrP蛋白的1.6倍（图2B）。这些结果提示重组人PrP蛋白经 Cu2+诱导后仍可被ADAM10剪切。

A.Western b1ot结果；B.灰度值量化分析结果，剪切片段/相应全长PrP图2　Cu2+诱导后PrP蛋白的ADAM10剪切试验A.Western b1ot with PrP-specific monoc1ona1 3F4.B.Densitometryana1ysis of the average gray va1ue of the PrP segment.Data were presented as the ratio of segmented PrP to corresponding fu11-1ength oneFig.2 Assays of ADAM10 treatment of Cu2+-induced PrP

2.3Cu2+诱导的重组人PrP蛋白经ADAM10处理后的PK消化特点 为了分析Cu2+诱导后重组人PrP蛋白经ADAM10剪切后的特点，我们将经6.4 μg/m1 ADAM10处理的未经 Cu2+诱导及经Cu2+诱导后的重组人PrP蛋白进行PK消化特点的分析。Western b1ot结果显示未经Cu2+诱导的PrP蛋白，无论是否经过ADAM10处理都无法抵抗PK的消化作用（图3A），而Cu2+诱导的PrP蛋白经ADAM10处理后具有比之前未经ADAM10处理更强的抵抗PK消化的作用（图3B）。灰度值量化结果显示，未经ADAM10处理的Cu2+诱导的全长PrP蛋白可抵抗5 μg/m1的PK消化，而经ADAM10处理后可抵抗10 μg/m1的PK消化（图3C）。相似的结果在抵抗PK消化的PrP剪切片段中也可看出，未经ADAM10处理的Cu2+诱导PrP的PK抗性片段可抵抗20 μg/m1的PK消化，而经ADAM10处理的则可抵抗80 μg/m1的PK消化（图3D）。这些结果提示ADAM10对Cu2+诱导PrP蛋白的处理可能阻碍了PK在PrP蛋白上的剪切结合位点，从而使其具有更强的抵抗PK消化的特点。

A.未经Cu2+诱导的PrP；B.经Cu2+诱导后的PrP；C.量化分析结果显示不同浓度PK消化后剩余全长PrP所占未经任何处理的PrP蛋白的灰度值百分比；D.不同浓度PK消化后PrP片段所占未经任何处理的PrP蛋白的灰度值百分比。设未经任何处理的全长PrP的灰度值为1图3　经ADAM10处理后Cu2+诱导的PrP蛋白的PK消化试验A.Without Cu2+-induced PrP.B.With Cu2+-induced PrP.C.Densitometry ana1ysis of the percentage of the gray va1ues of remaining fu11 1ength PrP to that of origina1 untreated fu11 1ength PrP according to the various concentrations of PK.D.Densitometry ana1ysis of the percentage of the gray va1ues of the remaining PrP segment to that of origina1 untreated fu11 1ength PrP according to the various concentrations of PK.The gray va1ue of origina1 untreated fu11 1ength PrP is set to 100%.Fig.3 Assays of PK-resistances in Cu2+-induced PrP treated by ADAM10

3 讨论

总所周知，二价金属离子可以结合PrP蛋白，同时许多朊病毒病感染者脑组织中也都可以发现这种二价金属离子含量的变化［4-5］，提示二价金属离子参与了PrPC向PrPSc的转化。由于PrPSc具有抵抗PK抗性的特点，故目前主要利用这一重要特点鉴别PrPSc与PrPC。已有研究显示Cu2+诱导后的PrP蛋白会改变对PK消化的敏感性［5］。本研究中，我们通过Cu2+诱导的重组PrP蛋白具有部分抵抗PK消化的特性，很好地模拟了Cu2+对PrP的作用，同时提示铜离子可能是PrPC向PrPSc的转化过程中的一个协同因子。

作为一个具有催化活性的金属蛋白酶，有研究认为 ADAM10参与了培养细胞中 PrPC的“α-剪切”［8-9］，剪切位点为氨基酸110和111之间。我们之前的结果证明对重组PrPC的剪切位点可能在PrP蛋白的跨膜区（氨基酸第111-134位）。事实上，对于ADAM10在PrP蛋白上的剪切位点仍旧存在争议［10-12］。但是我们的结果直接证明了ADAM10不仅能够水解正常的PrP重组蛋白，还能够水解Cu2+诱导后的人PrP蛋白。我们分析由于Cu2+与PrP蛋白的结合位点主要在八肽重复区（氨基酸第51-91位），故PrP蛋白的N端结合Cu2+后不会对PrP蛋白的跨膜区及C端的结构造成影响，这也是ADAM10能够进一步剪切Cu2+诱导的PrP蛋白的分子基础。

PrP蛋白和ADAM10均是膜蛋白，它们有足够的空间进行相互作用，这在我们之前的研究中已经证明［6］。在本研究中，ADAM10处理Cu2+诱导后的PrP蛋白具有的PK抗性明显强于未经ADAM10处理的Cu2+诱导后的PrP蛋白，我们推测这可能是由于空间位阻效应所造成的。由于Cu2+诱导后的PrP蛋白的N端的空间结构要明显复杂于未经Cu2+诱导后的PrP蛋白致使不易被PK完全消化，而此时进一步增加ADAM10的处理即进一步复杂了或直接占位了PK的消化位点，致使低浓度的PK无法与靶蛋白完全结合，导致其具有更强的PK抗性。由于PrP蛋白是参与体内铜离子代谢作用的主要转运蛋白，这种情况在体内应极易发生，那么在生理条件下如何避免这种抵抗消化作用的发生以及机体调控异常时这种抵抗消化作用的存在是否有益于PrPSc的侵染和复制需待下一步的深入研究。

［1］ Prusiner S，Scott M，DeArmond S，et a1.Prion protein bio1ogy. Ce11，1998，93：337-348.doi：10.1016/S0092-8674（00）81163-0.

［2］ Prusiner SB.Prions.Proc Nat1 Acad Sci USA，1998，95：13363-13383.doi：10.1073/pnas.95.23.13363.

［3］ Tay1or DR，Hooper NM.The prion protein and 1ipid rafts.Mo1 Membr Bio1，2006，23：89-99.doi：10.1080/09687860500 449994.

［4］ Hesketh S，Sassoon J，Knight R，et a1.E1evated manganese 1eve1s in b1ood and centra1 nervous system occur before onset of c1inica1 signs in scrapie and bovine spongiform encepha1opathy.J Anim Sci，2007，85：1596-1609.doi：10.2527/jas.2006-714.

［5］ Lorena VN，A1fonso G，Niba1do CI.Ro1e of Copper in Prion Diseases：De1eterious or Beneficia1.Curr Pharm Des，2006，12：2587-2595.doi：10.2174/138161206777698873.

［6］ Chen C，Lv Y，Zhang BY，et a1.Apparent reduction of ADAM10 in scrapie-infected cu1tured ce11s and in the brains of scrapieinfected rodents.Mo1 Neurobio1，2014，50：875-887.doi：10.1007/s12035-014-8708-7.

［7］ Dong CF，Shi S，Wang XF，et a1.The N-terminus of PrP is responsib1e for interacting with tubu1in and fCJD re1ated PrP mutants possess stronger inhibitive eVect on microtubu1e assemb1y in vitro.ArchBiochem Biophys，2008，470：83-92.doi：10.1016/j.abb.2007.11.007.

［8］ Vincent B，Paite1 E，Saftig P，et a1.The disintegrins ADAM10 and TACE contribute to the constitutive and phorbo1 esterregu1ated norma1 c1eavage of the ce11u1ar prion protein.J Bio1 Chem，2001，276：37743-37746.doi：10.1074/jbc.m004628 200.

［9］ Cisse MA，Sunyach C，Lefranc-Ju11ien S，et a1.The disintegrin ADAM9 indirect1y contributes to the physio1ogica1 processing of ce11u1ar prion by modu1ating ADAM10 activity.J Bio1 Chem，2005，280：40624-40631.doi：10.1074/jbc.m506069200.

［10］ Tay1or DR，Parkin ET，Cock1in SL，et a1.Ro1e of ADAMs in the ectodomain shedding and conformationa1 conversion of the prion protein.J Bio1 Chem，2009，284：22590-22600.doi：10.1074/ jbc.m109.032599.

［11］ Endres K，Mitteregger G，Kojro E，et a1.Inf1uence of ADAM10 on prion proteinprocessingandscrapieinfectiosityinvivo. Neurobio1 Dis，2009，36：233-241.doi：10.1016/j.nbd.2009. 07.015.

［12］ A1tmeppen HC，Prox J，Puig B，et a1.Lack of a-disintegrin-andmeta11oproteinase ADAM10 1eads to intrace11u1ar accumu1ation and 1oss of shedding of the ce11u1ar prion protein in vivo.Mo1 Neurodegener，2011，6：36.doi：10.1186/1750-1326-6-36.

Enhanced PK-resistance of the Cu2+-induced recombinant prion protein treated by ADAM10

ChenCao，Lyu Yan，Shi Qi，Dong Xiaoping National Institute for Viral Disease Control and Prevention，State Key Laboratory for Infectious Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China

Dong Xiaoping，Email：dongxp238@sina.com

Objective To ana1yze the characteristics of the ADAM10 c1eavage on the Cu2+-induced recombinant prion protein.Methods Recombinant human prion protein（PrP，aa 23-230）was expressed and purified by routine methods.The purified human PrP was induced by copper ch1oride.Subsequent1y，the Cu2+-induced recombinant human PrP was treated with various concentrations of ADAM10 and its PK-resistance was assessed by PrP-specific Western B1ot after incubating with various concentrations of proteinase K.Results The Cu2+-induced purified recombinant prion protein has the characteristic of partia1 PK-resistance.ADAM10 can c1eavage the Cu2+-induced purified recombinant prion protein，with a dosedependent manner.The PK-resistance abi1ity of ADAM10-treated Cu2+-induced purified recombinant prion protein is higher than that of ADAM10-untreated one.Conclusions ADAM10 can c1eavage the Cu2+-induced purified recombinant prion protein and enhance the PK-resistance abi1ity of the treated prion protein.

Prion protein；Cu2+；ADAM10；PK-resistance；c1eavage

国家自然科学基金（81401670，81572048，81301429）；传染病预防控制国家重点实验室（2012SKLID102，2015SKLID503）

董小平，Emai1：dongxp238@sina.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.001

2016-02-02）