广西地区三类人群EB病毒潜伏膜蛋白2特异性细胞免疫状态的研究

邓卓霞 王勇利 杜海军 司勇锋 兰桂萍 孙金杰 杨涌 韩星

530021南宁，广西壮族自治区人民医院耳鼻咽喉头颈肿瘤科（邓卓霞、王勇利、司勇锋、兰桂萍、孙金杰、杨涌、韩星）；100052北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室（杜海军、周玲）

广西地区三类人群EB病毒潜伏膜蛋白2特异性细胞免疫状态的研究

邓卓霞 王勇利 杜海军 司勇锋 兰桂萍 孙金杰 杨涌 韩星

530021南宁，广西壮族自治区人民医院耳鼻咽喉头颈肿瘤科（邓卓霞、王勇利、司勇锋、兰桂萍、孙金杰、杨涌、韩星）；100052北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室（杜海军、周玲）

目的 初步探讨广西地区鼻咽癌患者、血清VCA/IgA阳性高危人群及血清VCA/IgA阴性健康人群EB病毒LMP2特异性细胞免疫状态的差异。方法 选择广西苍梧地区经血清学筛查VCA/IgA阳性高危人群志愿者60例，对照为血清VCA/IgA筛查阴性的健康志愿者20例，同时选取广西壮族自治区人民医院经病理确诊鼻咽癌患者134例，分离外周血单个核细胞（PBMC），采用酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测外周血中LMP2特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）免疫水平。比较鼻咽癌患者与健康志愿者、高危人群外周血LMP2特异性CTL免疫状态的差异。结果 鼻咽癌患者LMP2特异性CTL免疫水平明显低于健康志愿者及血清EB病毒抗体阳性人群，差异有统计学意义（P＜0.01）；血清EB病毒抗体阳性三种不同滴度人群间LMP2特异性T细胞免疫反应差异有统计学意义（P=0.002）；鼻咽癌Ⅰ、Ⅱ期患者同Ⅲ期及Ⅳ期患者的LMP2特异性T细胞免疫反应存在差异（P＜0.01）。结论 三类人群间LMP2特异性CTL水平的差异可能是导致EB病毒长期潜伏感染并导致鼻咽癌发生的重要原因，针对LMP2的特异性免疫治疗有望降低鼻咽癌的发生率。

【主题词】 鼻咽癌；EB病毒；LMP2；ELISPOT；特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）；免疫治疗

Fundprogram：Natura1ScienceFoundationofGuangXiZhuangAutonomousRegion （2011GXNSFA018235）；Science and Techno1ogy P1anning Project of GuangXi Zhuang Autonomous Region （14124003-3，14279008）

鼻咽癌是来源于鼻咽部上皮的一种恶性肿瘤，在我国东南沿海地区高发，广西苍梧县是世界级鼻咽癌高发区，发病率高达50/10万以上［1-3］。在众多的发病因素中，EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染仍然是鼻咽癌发病的主要因素之一［4，5］。在鼻咽癌组织中，EBV主要表达潜伏膜蛋白1（LMP1）、潜伏膜蛋白2（LMP2，包含LMP2A、LMP2B）、EBV核抗原1（EBNA1）等抗原。有研究认为LMP2可以提高上皮细胞生长和分化能力，并且与鼻咽癌的侵袭和转移有一定的相关性［6］，因此针对LMP2的特异性免疫检测可一定程度上反映机体对EBV的免疫状态。目前已有部分研究在这方面做了有效的尝试［7，8］，但也存在着入选病例少，缺少不同滴度高危人群间的比较，无病例追踪随访等不足。我们对广西地区健康志愿者（20例）、鼻咽癌高危人群（60例）、鼻咽癌患者（134例）进行了EBV-LMP2特异性免疫检测，并进行了详细的对比研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1研究对象 选择广西苍梧地区经免疫酶法血清学筛查明确为高危人群（VCA/IgA阳性）的志愿者60例，年龄30～69岁，平均年龄44.5岁，男性23例，女性37例，其中1∶5滴度27例、1∶10滴度22例、1∶20滴度8例、1∶40滴度3例；健康对照组为该地区VCA/IgA筛查阴性的志愿者20例，年龄26～61岁，平均年龄47岁，男性9例，女性11例；同时选择广西壮族自治区人民医院耳鼻咽喉头颈肿瘤科2011年9月-2013年1月收治的鼻咽癌志愿者134例，年龄20～70岁，平均年龄46.5岁，其中男性89例、女性45例。所有患者均经过鼻咽部组织病理确诊，并按照 UICC2002分期进行临床分期：Ⅰ期6例、Ⅱ期33例、Ⅲ期47例、Ⅳ期48例。该研究项目获广西壮族自治区人民医院伦理委员会批准实施，所有志愿者均签署知情同意书。

1.2外周血单个核细胞采集及保存 所有待检测人群（鼻咽癌患者在未行治疗前）抽取肘静脉血6～8 m1（BD EDTA抗凝真空采血管），采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（periphera1 b1ood mononuc1ear ce11，PBMC），1×PBS洗涤2次，细胞计数后调整细胞最终浓度为5×106个/m1，加入含有10%DMSO的冻存液中，放入-80℃低温冰箱中梯度降温，过夜后转入液氮保存。

1.3细胞的复苏及活性检测 ELISPOT检测第1天时将细胞冻存管从液氮中取出，迅速置于37℃水浴锅中解冻，后用5倍体积的1640培养基洗涤2次，放入含有10%胎牛血清的1640培养基10 m1，重悬后置于二氧化碳培养箱中过夜，第2天取20 μ1细胞悬液加入胎酚兰染色计数，后将细胞终浓度调整为2×106个/m1备用。

1.4EB病毒LMP2特异性T细胞免疫反应检测

按照ELISPOT试剂盒（551849，BD美国）说明，第1天将包被抗体储存液稀释在无菌1×PBS缓冲液中，每孔加入100 μ1（96孔板），4℃包被过夜。第2天倾倒包被液，加入200 μ1/孔含10%FBS 1640的封闭液，洗板1次，加入200 μ1/孔含10%FBS 1640封闭液，室温孵育2 h。倾倒封闭液，接种细胞，加入刺激物，培养淋巴细胞的稀释：先将100 μ1浓度为2×106/m1的细胞悬液加入培养孔（100 μ1/孔，复孔），后分别加入 LMP2特异性多肽（参考LMP2多肽库的序列图，由中国疾病预防控制中心实验室合成），设立阴性对照孔（加入100 μ1细胞培养液），阳性对照孔加入2 μ1植物血凝素（PHA），空白对照（培养液）；盖上板盖，放入37℃、5%CO2培养箱培养24 h。第3天，倾倒孔内的细胞及培养基，去离子水洗板2次后再用1×PBST（含0.05% Tween-20的1×PBS）洗板3次，加入检测抗体100 μ1/孔，加盖后室温放置2 h；弃检测抗体，每孔用200 μ1 PBST洗涤3次，每孔加入链霉亲和素标记-HRP 100 μ1，室温孵育1 h；每孔用200 μ1 PBST洗涤4次后再用200 μ1 1×PBS洗涤2次；每孔加入100 μ1的AEC显色液，室温静置5～60 min，随时观察显色斑点大小，待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2次，终止显色，室温静置10～30 min，让膜自然晾干。将ELISPPOT板置于Biosys Bioreader 4000 PRO自动读板仪内，调节好合适的参数，斑点计数，并记录斑点的各种参数。

1.5ELISPOT实验结果的判定 ELISPOT阳性点数的计算：试验组与阴性对照组都扣除背景（空白对照）后，ELISPOT阳性点数=（试验组复孔的点数和-阴性对照组复孔的点数和）/2，结果四舍五入；当两者差值为负数时计阳性点数为0。同时根据美国和国内相关报道提出的标准［9］：特异性肽刺激孔形成的斑点数＞2×无特异性肽刺激的对照孔的斑点数，并且特异性肽刺激孔形成的斑点数＞10个斑点，则判为阳性；如阴性对照孔的斑点数为0，则特异性肽刺激孔形成的斑点数＞10个斑点，即判为阳性。为保证实验结果的真实准确，实验试剂采用同一厂家、同一批次。

1.6统计学方法 应用SSPS19.0统计软件对实验数据进行统计学分析，对鼻咽癌患者、高危人群与健康志愿者的LMP2A特异性T细胞（CTL）免疫反应细胞数目进行Kruska1-Wa11is H检验，并绘制茎叶图，检验水准P=0.05。

2 结果

2.1三类人群LMP2A特异性T细胞免疫反应比较 鼻咽癌患者LMP2A特异性CTL水平明显低于健康志愿者及血清EB病毒抗体阳性人群，差异有统计学意义（P＜0.01），且三类人群组间比较均有统计学意义（P＜0.01），见图1。

图1　三类不同人群间EBV-LMP2A特异性CTL水平的比较Fig.1 Comparison of EBV-LMP2A specific CTL 1eve1s among three different groups

2.2健康人群同血清VCA/IgA 1∶5滴度人群间的比较 两者间的LMP2A特异性CTL免疫反应差异无统计学意义（P=0.085）。

2.3血清EB病毒抗体阳性三种不同滴度 人群间LMP2A特异性CTL免疫反应差异有统计学意义（P=0.002），经两两比较血清滴度12∶0及以上组同1∶5组、1∶10组之间的LMP2A特异性CTL水平存在差异，差异有统计学意义（P值分别为 0.002，0.037）；而抗体滴度1∶5组与1∶10组的LMP2A特异性CTL水平差异无统计学意义（P=0.057），见图2。

图2　不同VCA/IgA滴度人群EBV-LMP2A特异性CTL水平的比较Fig.2 Comparison of EBV-LMP2A specific CTL 1eve1s among different VCA/IgA titer groups

2.4高危人群中血清 VCA/IgA 1∶20及以上滴度人群同早期（Ⅰ、Ⅱ期）鼻咽癌患者间的比较，见两者间的LMP2A特异性CTL免疫反应差异有统计学意义（P=0.02），早期鼻咽癌患者的LMP2A特异性CTL免疫状态仍低于血清 VCA/IgA 1∶20滴度人群。

2.5鼻咽癌不同临床分期患者间LMP2A特异性T细胞免疫反应比较 所有鼻咽癌患者按照临床分期分为Ⅰ、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期三组，经过比较得知三组间的LMP2A特异性CTL免疫反应存在差异（P= 0.002）；两两比较：Ⅰ、Ⅱ期同Ⅲ期患者间，Ⅰ、Ⅱ期同Ⅳ期患者间，Ⅲ期同Ⅳ期患者间比较均有统计学意义（P＜0.01、P=0.042），见图3。

3 讨论

图3　不同临床分期鼻咽癌患者间EBV-LMP2A特异性|CTL水平的比较Fig.3 Comparison of EBV-LMP2A specific CTL 1eve1s among different stage in patients of nasopharyngea1 carcinoma

在鼻咽癌患者中，肿瘤细胞抗原呈潜伏Ⅱ型表达，即表达EBNA1、LMP1、LMP2［5］。LMP2A在肿瘤组织中能持续表达［10］，且含有多种受HLA限制的细胞毒性 T淋巴细胞（CTL）表位，序列较保守。EBV潜伏感染的外周血B细胞中可检测到LMP2A表达，LMP2A是静止B细胞中唯一可检测到的EBV潜伏期基因表达产物，并且是鼻咽癌、淋巴癌等肿瘤细胞能稳定表达的少数EBV保守抗原之一，具有潜在的T细胞激活表位，能介导杀伤性T细胞发挥作用。

在人体内针对病毒的免疫反应中，细胞免疫起主要作用，而T细胞是细胞免疫中能够直接杀伤外来入侵抗原的主要细胞之一。特异性CTL细胞能否识别并杀伤靶细胞是能否清除EBV感染并抑制其进一步发展的关键；而肿瘤患者其自身的EB病毒特异性CTL的免疫作用存在缺陷，必须增强肿瘤细胞的抗原性，让EBV特异性CTL可以更好的识别，从而达到杀伤肿瘤细胞的作用。LMP2A通过HLA-A2限制性CTL来被免疫系统识别、产生免疫反应，进而杀伤靶细胞，越来越多的研究也表明，LMP2A是治疗EBV相关肿瘤理想的靶抗原［11-13］。

本研究显示，鼻咽癌患者外周血LMP2A特异性的CTL细胞数目明显少于EB病毒血清学阳性人群及健康志愿者，且组间的差异有统计学意义，这提示鼻咽癌患者对LMP2A抗原刺激的免疫反应能力明显低于血清学阳性人群，同时EB病毒血清学阳性人群对LMP2A抗原刺激的免疫反应能力也低于健康人群。Mo等［8］对不同分期鼻咽癌患者治疗前的EBV-LMP2特异性免疫状态对比研究，也得到了相似的结论。另外，Portis等［14］发现LMP2A可增强细胞周期诱导和凋亡抑制等相关基因的表达，改变DNA和RNA新陈代谢相关基因表达，减少B细胞特异性因子和免疫相关基因的表达。由于LMP2A 对EBV的潜伏感染起到重要的作用，可能是EBV相关的恶性肿瘤发生、发展的重要环节之一：机体对LMP2A的免疫识别和清除能力下降，使表达LMP2A 的B淋巴细胞增殖，LMP2A又可以抑制免疫相关基因的表达，进一步降低机体对LMP2A的免疫能力，这一循环可能导致EBV在局部长期感染并不断增殖，刺激鼻咽上皮增生，最终导致肿瘤的最终发生。另外，不同人群间的EBV-LMP2特异性免疫差异也是LMP2A免疫治疗的基础，通过早期对有高危人群的免疫干预有可能会阻止疾病的发生。

本研究发现在鼻咽癌高危人群中，不同滴度人群对LMP2A抗原刺激的免疫反应能力也存在差异，高滴度人群的LMP2A特异性细胞免疫状态要低于低滴度人群。由于血清学滴度可以间接反映出EB病毒潜伏感染的状态，因此两者检测存在着一致性。在鼻咽癌患者中早期患者的LMP2A特异性细胞免疫状态要好于晚期患者，其可能原因是早期患者的肿瘤较局限，循环中的肿瘤细胞较少，机体也可存在一定程度特异性细胞免疫。本研究中健康人群同血清VCA/IgA 1∶5滴度人群之间、1∶5滴度人群同1∶10滴度人群之间的LMP2A特异性免疫状态无统计学差异，这可能受入组人数的影响所致，具体差异情况可能需要更大样本量的研究验证。

近年来，EBV-LMP2特异性CTL在临床中的应用也引起人们的关注。中国台湾学者林成龙等［15］用DC负载LMP2多肽对鼻咽癌患者进行临床试验，发现16例鼻咽癌治疗后复发或者远处转移的病人中，有9例患者的特异性免疫被诱导出或者被增强，并且这种特异性免疫持续3个月之久，同时也发现其中2例患者的局部肿瘤部分消退。中国香港Hui等［16］及英国 Tay1or等［17］进行的以 LMP2A及EBNA1多肽为免疫原的MVA-EL疫苗I期临床试验，也取得了较好的免疫效果，安全性也得到了肯定。国内目前本单位在曾毅院士的带领下已经完成将LMP2A作为疫苗免疫EBV阳性的鼻咽癌患者，Ⅰ期临床试验结果提示安全且能有效提高特异性免疫反应，下一步计划在高危人群中进行相应的免疫研究。

尽管EBV相关肿瘤病因学中EBV的确切作用并不十分清楚，但肿瘤细胞中EB病毒的存在、鼻咽癌患者对于LMP2A特异性的T细胞免疫下降可能是导致鼻咽癌发生的重要原因之一，通过提高机体对LMP2A的识别及免疫反应，可能是对鼻咽癌患者进行免疫治疗的有效途径之一。

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Analysis of EB virus LMP2 specific immune status among three groups in Guangxi area

DengZhuoxia，Wang Yongli，Du Haijun，Si Yongfeng，Lan Guiping，Sun Jinjie，Yang Yong，Han Xing Department of Otolaryngology Head and Neck Tumor，People's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning 530021，China（Deng ZX，Wang YL，Si YF，Lan GP，Sun JJ，Yang Y，Han X）；National Institute for Viral Disease Control and Prevention，State Key Laboratory for Infections Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100052，China（Du HJ，Zhou L）

Si Yongfeng，Email：syfklxf@126.com

Objective To investigate the difference of EB-LMP2 specific immune status among patients with nasopharyngea1 carcinoma，serum EBV VCA/IgA positive group and EBV VCA/IgA negative group in Guangxi area of china.Methods 60 cases of serum EBV VCA/IgA screening positive vo1unteers and 20 cases of negative vo1unteers came from Cangwu county in Guangxi area，and 134 cases of patients vo1unteers with nasopharyngea1 carcinoma（NPC）came from The Peop1e′s Hospita1 of Guangxi Zhuang Autonomous Region.B1ood samp1es were taken before any treatment，and the preiphera1 b1ood mononuc1ear ce1s（PBMC）were taken by Fico11 density gradient centrifugation.Specific immune responses of cytotoxic T 1ymphocytes（CTLs）were measured using IFN-γ ELISPOT assays with HLA-matched LMP2 epitope peptides.Results LMP2 specific immune responses 1eve1s in nasopharyngea1 carcinoma patients were significant1y 1ower than those hea1thy vo1unteers and serum EBV VCA/IgA screening positive vo1unteers（P ＜0.01），and the immune responses were statistica11y different in three VCA/IgA titers（1∶5，1∶10 and 1∶20 or more，P=0.002）；LMP2 specific immune responses in ear1y stage patients of nasopharyngea1 carcinoma （stage I/II）were better than those advanced stage（stageⅢ and stage IV）（P＜0.01）.Conclusions The difference of LMP2 specific CTL 1eve1s among three groups may be the important reason for the 1ong-term1atent infection of EB virus and 1ead to the occurrence of nasopharyngea1 carcinoma，and LMP2 specific immunotherapy is expected to reduce the incidence of nasopharyngea1 carcinoma.

Nasopharyngea1 carcinoma（NPC）；EB virus；LMP2；ELISPOT；cytotoxic 1ymphocyte，CTL，immunotherapy

广西自然科学基金（2011GXNSFA018235）；广西科技攻关计划项目（14124003-3、14279008）

司勇锋，Emai1：syfk1xf@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.021

2015-12-07）