PDGF在实验性牙周改建过程中的表达变化

王素（杭州口腔医院，浙江杭州310006）

PDGF在实验性牙周改建过程中的表达变化

王素
（杭州口腔医院，浙江杭州310006）

目的探讨PDGF-AA在实验性牙周组织改建过程中的表达变化。方法建立大鼠试验性正畸牙移动的动物模型，随机选择一侧加力作为实验组，对侧不加力作为对照组。测量正畸后牙齿的移动距离，应用免疫组织化学方法标记PDGF-AA，对各组表达强度进行半定量分析。 结果PDGF-AA表达于正常牙周组织中。在实验性正畸牙齿移动过程中：（1）正畸牙移动的距离和PDGF-AA在牙周组织内的表达及分布随加力时间的增加，差异无统计学意义（P＞0.05）；（2）实验组PDGF-AA的色度值高于对照组（P＜0.05）；受压侧色度值显著低于牵张侧（P＜0.05）；（3）PDGF-AA表达的变化与牙移动的距离之间无显著的相关性 （r＜0.5）。结论正常牙周组织表达PDGF-AA，且PDGF-AA参与正畸牙移动的骨改建过程，且在骨形成的牵张侧表达高于骨吸收的受压侧。

血小板衍生生长因子；牙周改建；免疫组织化学染色；牙移动

牙周组织在人的一生中不断改建，近年研究表明，正畸过程中牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament fibroblast，PDLF）首先接受正畸力产生骨改建，导致牙移动［1］。PDLF向牙槽骨表面迁移并分化为成骨细胞，成骨细胞和成牙骨质细胞不断地形成新的牙槽骨和牙骨质，发生骨改建［2-4］。骨改建与很多细胞因子有关，包括血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）［5］。PDGF参与骨细胞增殖、发化以及基质的含成，其中PDGF-AA可由正常人体骨细胞表达，骨组织中含量丰富，是一种骨代谢调节因子。本实验借助正畸牙移动的牙周改建模型，探讨PDGF-AA在牙周中的表达及初步研究随加力、时间的变化，PDGF的表达及其在牙周改建中的作用。

1　材料与方法

1.1实验材料（1）实验动物：选取Wistar大鼠18只（湖北省医科院实验动物中心提供），雌性，体质量220～250g。（2）实验材料及仪器：0.2mm正畸不锈钢结扎丝（上海埃蒙迪材料科技）；镍钛螺旋弹簧（上海埃蒙迪材料科技）；测力计。（3）主要试剂：山羊抗大鼠PDGF-AA多克隆抗体（Santa Cruz Company）；SP免疫组化试剂盒 （北京中杉生物技术有限公司）。（4）主要仪器：光学显微镜（Olympus BHS-313，Japan）；体式数码显微摄影系统（Zeiss，Germany）。

1.2实验方法

1.2.1动物模型的建立将18只大鼠随机分成3天组、7天组和14天组，每组6只。通过自身左右对照，随机选定一侧上颌第一磨牙为实验组，对侧上颌第一磨牙为对照组。对大鼠进行麻醉，使用牙科高速涡轮车针在实验动物上颌切牙唇侧、腭侧和实验侧第一磨牙近中轴面角处分别作一个深0.3～0.5mm的固位沟（图1），实验组用0.2mm正畸不锈钢结扎丝将镍钛螺旋弹簧结扎在上颌切牙和第一磨牙间，测力使螺旋弹簧均产生力值约50g的拉力，牵引上颌第一磨牙向近中移动（图2）。第一磨牙正畸移动过程中，近中为受压侧，远中为牵张侧。对照组不做以上牵引。

1.2.2标本的获取正畸手术后3、7、14天时将动物处死。取含两侧上颌第一磨牙及其周围牙槽骨的组织块，常规固定，4℃下10%EDTA脱钙6～9周，60%～100%梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。制备5μm连续切片。对同一只大鼠的实验侧和对照侧同时进行免疫组化定位。

1.3观察指标

1.3.1正畸后牙移动距离的测量使用体式数码显微摄影系统（Zeiss，Germany）对正畸后两侧上颌牙进行拍照，在摄影过程中保持各组上颌第一磨牙的牙合面垂直于摄影球管的中心线，以保证测量结果的一致性。使用WCIF Image J分析软件测量牙移动的距离。

1.3.2免疫组化的半定量分析利用色度值进行半定量分析。在组织切片上确定2个测量部位：第一磨牙根中1/3处近中（受压侧）、远中（牵张侧）侧。制定色度分级评分标准（图3～5，0分与2分之间为1分，2分与4分之间为3分）。统一培训后两人分别独立打分后取平均值，检测各组标本平均色度值。以PBS代替一抗的空白对照作为阴性对照。

图1　制作固位沟

图2　正畸牵引上颌第一磨牙向近中移动

图3　PDGF-AA-R色度值为0分

图4　PDGF-AA-R色度值为2分

图5　PDGF-AA-R色度值为4分

1.4统计学处理应用SPSS 10.0 for windows软件，实验组和对照组采用自身配对t检验，各组间进行方差分析，将牙移动的距离和PDGF-AA-R表达的色度值进行相关性分析。

表1　不同时间段实验组和对照组、受压侧和牵张侧正畸牙移动距离与色度值的关系

2　结果

2.1移动距离与色度值在1030像素下实验组移动距离在3天、7天和14天之间，差异无统计学意义（P＞0.05），在各时间点，色度值实验组与对照组差异有统计学意义（P＜0.05），受压侧色度值显著低于牵张侧，差异有统计学意义（P＜0.05）。PDGFAA表达的变化与牙移动的距离之间无显著相关性（r＜0.5）。

2.2免疫组化免疫组化染色结果证实，PDGF-AA存在于正常大鼠的牙周组织中（下图均为第一磨牙的牙周和骨组织）（图6），且主要表达于牙龈细胞及牙周组织的牙周膜成纤维细胞和牙槽骨表面的成骨细胞胞膜和胞浆中，呈阳性表达。阴性对照、对照组及实验组的PDGF-AA表达情况详见图7～9。

图6　PDGF-AA在正常牙周组织中的表达（×100）

图7　阴性对照（以PBS代替一抗）（×100）

图8　对照组（弱阳性表达）（×100）

图9　实验组（强阳性表达）（×100）

3　讨论

正畸牙齿移动的过程实质是牙周组织进行不断改建的过程，而牙周组织的改建最终主要表现为牙槽骨的改建。牙周组织的改建过程十分复杂，是一个多因素的调控体系网。在众多的影响因素中，生长因子的局部调控发挥着重要作用［6］，因此研究骨生长因子的改变对进一步阐明骨改建发生机理具有重要的理论和实践意义。血小板衍生生长因子是骨改建的一种调控因子，主要促进骨细胞的合成和细胞复制，加速骨质形成。实验研究证明，血小板衍生因子能够促进骨细胞的分裂、增殖，调节骨细胞的功能，对骨形成有一定的促进作用［7-8］。

本实验中，对牙槽骨进行改建，PDGF-AA的表达在加力的实验组显著高于未加力的对照组，推测在PDGF-AA很可能参与牙槽骨的改建；并且还发现，PDGF-AA的表达在骨形成的牵张侧高于骨吸收的受压侧，推测PDGF-AA参与了骨的形成和吸收，并且可能在牙移动的过程中，介导骨形成的作用强于骨吸收。

本实验设置了3天、7天和14天组，随时间的增加，牙移动的距离和PDGF-AA的表达都未出现显著的增加。分析其原因：（1）实验使用的正畸力（50g）过大，导致骨改建过快，PDGF-AA的表达很快达到一个高峰值，导致差异不明显；（2）本实验的时间段设定较少；（3）实验动物样本量不够大，导致差异的偏差。

本实验的创新点在于发现在牙周组织中有PDGF-AA的表达，并对其在牙周骨改建中的作用进行了初步的探索研究，对进一步促进正畸牙移动骨改建、牙周组织修复与再生以及种植体周围牙周骨整合的形成具有重要意义。

［1］IsakaJ，OhazamaA，KobayashiM，etal.Participationof periodontal ligament cells with regeneration of alveolar bone. Periodontol，2001，72（3）：314

［2］Nemoto E，Shimonishi M，Nitta Y，et al.The involvement of platelet-derived growth factor receptors and insulin-like growth factor-Ⅰ receptors signaling during mineralized nodule formation by human periodontal ligament cells.J Periodontal Res，2004，39（6）：388

［3］ Ito-Kato E，Suzuki N，Maeno M，et al.Effect of carnosine on runt-related transcription factor-2/core binding factor alpha-1 and Sox9 expressions of human periodontal ligament cells.J Periodontol，2004，39（3）：199

［4］Yamaguchi N，Chiba M，Mitani H.The induction of c-fos mRNA expression by mechanical stress in human periodontal ligament cells.Arch Oral Biol，2012，47（6）：465

［5］Horowitz MO.Cytakines and estrogen in Bone：antiosteoporotic effects.Science，2008，260：626

［6］Schmid RL，Sandler AN，Katz J．Use and efficacy of low-dose ketamine in the management of acute postoperative pain：areviewofcurrenttechniquesandoutcomes．Pain，2009，82：111

［7］ Horner A，Bord S，Kemp P，et al.Distribution of plateletderived growth factor（PDGF），A chain mRN&protein and PDGF-alpha receptor in rapidly forming human bone．Bone，1996，19（4）：353

［8］Nash TJ，Howlety CR，Martin C，et a1．Effect of platelet derived growth factor on fibial oateotomies in rabbits．Bone，2004，15 （2）：203

·临床研究·