高效液相色谱法测定消炎止痢灵片中甲氧苄啶的含量

徐庆辉

(黄山市食品药品检验中心，安徽 黄山　245000)



高效液相色谱法测定消炎止痢灵片中甲氧苄啶的含量

徐庆辉

(黄山市食品药品检验中心，安徽 黄山245000)

摘要：目的建立测定消炎止痢灵片中甲氧苄啶含量的高效液相色谱法。方法采用高效液相色谱法，色谱柱为Phenomenex Luna C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)，流动相为乙腈-0.5%磷酸溶液(含1 mmol·L-1醋酸铵)(33∶67)，检测波长为270 nm。结果甲氧苄啶在0.1002～3.002 μg范围内与峰面积值呈良好的线性关系(相关系数为0.999 9)；平均回收率(n=6)为99.59%，RSD为0.22%。结论该方法简单，准确性高，精密度好，适合消炎止痢灵片中甲氧苄啶的含量测定。

关键词：色谱法,高压液相；甲氧苄啶；回收率

Determination of trimethoprim in Xiaoyanzhililing pian by HPLC

1　仪器与试剂

1.1仪器高效液相色谱仪(岛津LC-20AT)；AB135-S型十万分之一型电子天平(梅特勒-托利多)； BS110S型万分之一电子天平(北京赛多利斯)；ARA520型百分之一电子天平(梅特勒-托利多)；ElmasonicP180H型超声清洗器(德国艾玛)。

1.2试剂乙腈(色谱纯)；水(超纯水)；其它试剂(分析纯)。

2　实验方法

2.1色谱条件系统适应性试验色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Phenomenex Luna C185 μm 4.6 mm×250 mm)；乙腈-0.5%磷酸溶液(含1 mmol·L-1醋酸铵)(33∶67)为流动相，检测波长：270 nm，柱温：30℃，流速：1.0 mL·min-1。在此条件下供试品溶液的甲氧苄啶峰与相邻杂质峰达到基线分离。其保留时间为6.25 min，色谱柱理论板数甲氧苄啶峰计算为38 074，对照品色谱图见图1，供试品色谱图见图2。在200～800 nm波长进行扫描对照品溶液，甲氧苄啶的最大吸收波长在271 nm，选择270 nm为检测波长[4]。

2.2对照品溶液的制备精密称取甲氧苄啶对照品0.010 01 g，置100 mL容量瓶中，用甲醇使之溶解并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，作为对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备取本品装量差异项下的内容物适量，研细，取1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加70%乙醇溶液20 mL，称定重量，超声处理(功率500 W、频率53 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。

2.4阴性对照溶液的制备按本品的制备工艺，制成甲氧苄啶的阴性对照样品，再按供试品制备方法制成阴性对照溶液[5]。

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液各20 μL，注入液相色谱仪，依据上述色谱条件测定，记录色谱图，结果见图1～3。分离良好，阴性对照无干扰。

图1　甲氧苄啶对照品的HPLC图

图2　供试品的HPLC图

图3　阴性对照的HPLC图

2.5标准曲线的制备及线性范围的考察精密吸取甲氧苄啶对照品溶液1、2、5、10、20、30 μL进样，记录色谱峰面积，以对照品的峰面积(Y)对甲氧苄啶对照品溶液的进样量(X)回归，可得出得回归方程，相关系数r等。

免耕播种技术是技术的一种方法，是在地表存在农作物残茬的基础上，选择使用免耕播种机，一次性完成农作物播种施肥工作，有效降低了对土壤的翻动，减少机械设备在农业耕地上的反复碾压次数，降低人工成本投入。

2.6稳定性试验取对照品溶液分别于0、2、4、8、12 h 进样，记录峰面积，计算RSD(%)值，考察对照品溶液的稳定性。

2.7重复性实验取同一批号(20141220批)样品，照含量测定项下的测定方法，分别测定6次，记录色谱图，计算甲氧苄啶的含量(mg/g)及RSD(%)，考察样品溶液的重复性。

2.8加样回收率试验取同一批号(20141220批)样品(含量为18.149 mg/片)，取6份，每份1片，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，分别加入甲氧苄啶对照品适量置相应的锥形瓶中，精密加70%乙醇溶液20 mL，称定重量，超声处理(功率500 W、频率53 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。分别取供试品溶液20 μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以峰面积计算本法的回收率[6]，结果见下表1。

2.9样品测定及含量限度的确定按上述确定的色谱条件和测定方法，测定三批样品下消炎止痢灵片中甲氧苄啶的含量，结果见表2。

3　结果

3.1标准曲线由2.5标准曲线的制备方法，进样1、2、5、10、20、30 μL的峰面积为215882、434007、1119121、2235508、4468578、6836243。所得出的标准曲线：甲氧苄啶对照品在0.1002～3.002 μg范围内线性关系良好。标准方程为Y=230 000X-26 592，相关系数r=0.999 9。

3.4加样回收率由2.8实验方法所得加样回收率的结果：试验结果表明，该方法测定下的平均回收率为99.59%，RSD为0.22%，说明该种实验方法可行。见表1。

表1　准确度试验结果

3.5含量测定由2.9的实验方法可得：三批消炎止痢灵片中甲氧苄啶的含量较为稳定。见表2。

表2　三批样品含量测定结果

4　结论

4.1检测波长的选择取甲氧苄啶对照品溶液，照色谱条件依法进样，测定色谱峰在200～800 nm范围内的光谱图，结果如图4所示，由图可以看出甲氧苄啶不仅在271 nm处有最大吸收峰，而且在271 nm处峰的灵敏度较强，而其他无关峰的灵敏度相对较弱，因此就凸现出甲氧苄啶的峰，故选择270 nm作为测定波长[7]。

图4　甲氧苄啶的紫外光谱图

4.2流动相的选择采取高效液相色谱法测定药品中甲氧苄啶含量的论文已有许多，根据不同文献中提供的流动相，分别对水-乙腈-冰醋酸(65∶35∶2.5)、甲醇-水-醋酸(80∶19∶1)、乙腈-水-冰醋酸(35∶65∶2)、乙腈-0.5%磷酸溶液(含1 mmol·L-1醋酸铵)(33∶67)这四种流动相进行试验，结果表明以乙腈-0.5%磷酸溶液(含1 mmol·L-1醋酸铵)(33∶67)为流动相时，甲氧苄啶峰与其他杂质完全分离，且峰形更好[8]。

4.3提取方法的选择(1)溶剂的选择分别精密取10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、乙醇溶液各20mL，置于具塞瓶中，进行平行实验，测定消炎止痢灵片中甲氧苄啶的含量，发现70%的乙醇溶液提取效率比其他乙醇溶液的提取效率好，所以采用70%乙醇溶液为提取剂[9]。

(2)提取方法的优化比较回流加热与超声处理的优越性，分别以70%乙醇溶液为提取剂，对供试品分别进行加热回流和超声处理，发现超声处理的效果较好，且操作起来也方便些，所以采取超声处理10]。

(3)提取时间的确定取5份供试品溶液分别进行超声处理，提取时间依次设定为10、20、30、40、50 min，分别进行提取，结果发现样品在超声处理30 min后提取率基本上没有发生变化，最终确定超声30 min为最佳提取时间[11]。

5　讨论

利用高效液相色谱法测定消炎止痢灵片中甲氧苄啶的含量时，供试品溶液的主峰和甲氧苄啶对照品溶液的主峰在保留时间上是相同的，且甲氧苄啶的峰形较好[12]。

该样品处理方法较简单、方便且分离效果较好，有很好的专属性和稳定性，并且测定出的结果准确可靠、回收率高，是一种快速、灵敏、专属的检测方法，适合测定消炎止痢灵片中甲氧苄啶的含量。

参考文献

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doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.018

(收稿日期：2016-02-23，修回日期：2016-05-11)

XU Qinghui
(HuangshanInstituteforFoodandDrugControl,Huangshan245000,China)
Absract:ObjectiveTo establish a content determination method of trimethoprim in Xiaoyanzhililing pian by HPLC.MethodDetermined by HPLC,the column was Phenomenex Luna C18(5 μm 4.6 mm×250 mm),the mobile phase was acetonitrile -0.5%Phosphoric acid(include 1 mmol·L-1ammonium acetate)，the ditection wavelength was 270 nm.ResultTrimethoprim was linear in the range of 0.1002～3.002 μg(r=0.999 9);the average recovery was 99.59% and RSD was 0.22%(n=6).ConclusionsThis method is simple,accurate,precision and available for the determination trimethoprim in Xiaoyanzhililing pian.

Key words:Chromatography,High Pressure Liquid；Trimethoprim；Retrieving rate