醇提与水提工艺消栓通络片对大鼠局灶性脑缺血的治疗作用对比

李卓琼，宗绍波，周军，王振中，萧伟

(江苏康缘药业股份有限公司　中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏 连云港　222001)



醇提与水提工艺消栓通络片对大鼠局灶性脑缺血的治疗作用对比

李卓琼，宗绍波，周军，王振中，萧伟

(江苏康缘药业股份有限公司中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏 连云港222001)

摘要：目的对比研究改工艺后消栓通络片与市售消栓通络片对大鼠局灶性脑缺血的治疗作用差异。方法采用颈内动脉插入尼龙线栓的方法建立大鼠左侧大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion， MCAO)模型。观察给药后各组大鼠行为学评分、测定脑梗死面积及血清超氧化物歧化酶(SOD)、NF-κB、caspase-3含量的差异。结果改工艺后的消栓通络片高、中剂量组均能有效缓解4h，24h时MCAO引起的行为学病变，降低行为学评分；高、中、低剂量组均能升高MCAO引起的SOD降低；高、低剂量组能明显降低MCAO引起的血清NF-κB的升高；中、低剂量组对MCAO引起的Caspase-3的显著升高有一定抑制作用。与市售消栓通络片比较，改工艺消栓通络片从大鼠行为学评分的降低，血清SOD活性的增加，血清Caspase-3、NF-κB的表达效果均有优于市售消栓通络片的趋势。结论改工艺消栓通络片各剂量组对脑缺血进展期大鼠均有一定的恢复作用，其药效略优于市售消栓通络片。

关键词：中药工艺改进;黄芪;三七;槐花;丹参;缺氧缺血,脑;大鼠

消栓通络片是治疗中风恢复期的有效验方，有活血化瘀，温经通络的作用。临床常用于脑血栓引起的半身不遂，肢体麻木的治疗。我们对该方的传统制剂工艺进行了改进，将黄芪、三七、槐花、丹参四味药材由原工艺的水提改为60%醇提。制剂改进后规格由原来的1.8 g生药/片可增加为2.5 g生药/片，服药量将明显减少，增加病患用药依从性。本实验采用MCAO法制作大鼠脑缺血再灌注模型对比观察改工艺后消栓通络片与市售消栓通络片对大鼠局灶性脑缺血的治疗作用差异及其作用机制。

1　实验材料

1.1药物与试剂

1.1.1供试品改工艺消栓通络片浸膏粉由康缘现代中药研究院提供，规格：12.27 g生药/g提取物，批号130926。

供试品制备方法：将川芎、桂枝、木香、山楂、泽泻、郁金六味药材水煎，合并煎液，滤过、浓缩，加乙醇调至70%，静置，取上清液浓缩、干燥。黄芪、三七、槐花、丹参四味药材60%醇提，合并醇提液，滤过。大孔树脂纯化，浓缩，干燥。将两次所得干浸膏粉碎，加入适量辅料，混匀，加入冰片，混匀，制成颗粒，干燥，压制成片，包衣，制成2.5g生药/片的药物。

1.1.2对照药依达拉奉注射液：20 mL：30 g，2支装，吉林省辉南长龙生化药业股份有限公司，批号2013051002；消栓通络片(市售)：1.8 g生药/片，某公司，批号：130301。

1.1.3试剂水合氯醛，批号：20130426；羧甲基纤维素钠，批号：20120330；磷酸氢二钠，批号：20131125，均为国药集团化学试剂有限公司试剂。氯化钠，南京化学试剂有限公司，批号：11110421108。2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride(TTC)，sigma公司，Lot#BCBL1305V。核因子κB放免药盒，批号：20140401；活化半胱氨酸蛋白酶蛋白3放免试剂盒，批号：20140410；超氧化物歧化酶检测试剂盒，批号：20140101，均为北京华英生物技术研究所试剂。

1.2主要仪器电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；CENTRFUGE5840型冷冻离心机，Eppendorf；DK-S26恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；DHG-9076A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

1.3实验动物SD大鼠，雄性，体重280～330g，SPF(Specific Pathogen Free，无特定病原体)级，上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号码：SCXK(沪)2013-0016。

2　实验方法

2.1动物分组取体重280～330 g的雄性大鼠，随机分为7组。分组如下：假手术组(等容积5‰CMC-Na)、模型组(等容积5‰CMC-Na)、阳性药依达拉奉组(1.13 mg·kg-1大鼠)、市售消栓通络片组(2.7 g生药·kg-1大鼠)、消栓通络片高剂量组(0.44 g提取物·kg-1大鼠)、消栓通络片中剂量组(0.22 g提取物·kg-1大鼠)、消栓通络片低剂量组(0.11 g提取物·kg-1大鼠)

阳性药腹腔注射给药，1.13 mg·kg-1大鼠，其它各给药组大鼠于术前0.5 h灌胃给药1次，10 mL·kg-1大鼠。1次/d，连续3日，假手术组、模型组给予等容积5‰CMC-Na溶液。

2.2造模方法采用颈内动脉线栓法复制左侧大脑中动脉栓塞(MCAO)模型。参照文献方法加以改进[1]，分离出颈总动脉(Common Carotid Artery ，CCA)，继续向下分离并结扎颈外动脉(External Carotid Artery，ECA)，分离出颈内动脉(Internal Carotid Artery,ICA)，在ECA距ICA 2 mm处剪一小口，将一尼龙栓子插入ECA 并进入CCA，轻扎备线，防止出血。剪断ECA，松开ICA的动脉夹，牵引ECA，使其进入ICA，继续向下推进直至尼龙线插入深度约为18 mm停止。此时松开CCA动脉夹，扎紧备线，外留1 cm长线头，缝合皮肤，回笼饲养。

于缺血2 h后再灌注，再灌注时轻拉尼龙线，使尼龙线拔出ICA，进入ECA残端，血流再通，修剪尼龙线栓尾部，回笼自然喂养。

2.3评价指标

2.3.1对大鼠神经行为学的影响[1]见表1。

表1　大鼠行为缺陷评分标准

注：等级分数越高，表明动物的行为缺陷越严重。

2.3.2对缺血梗死面积的影响[2]TTC染色：大鼠于造模后72 h取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，置-20℃冰箱冰冻20 min，沿冠状面切成5片，每片约2 mm，置5 mL含有1%TTC的磷酸缓冲溶液中避光温孵10 min染色，4～5 min翻动一次。经染色后，正常脑组织呈玫瑰红色，而梗死组织呈白色。用图象测量软件Image pro-Plus分析脑片面积，分别计算出5个脑片共10个面的总面积和梗死区域的面积，求出梗死区面积占总面积的百分比，即梗死率。

2.3.3对血清超氧化物歧化酶(SOD)、NF-κB、caspase-3含量的影响造模后72 h，于最后一次给药后0.5 h，麻醉大鼠，劲总动脉插管取血，3 000 r·min-1离心10 min，分离血清，用生化法检测血清SOD活性，用放免法检测血清NF-κB、caspase-3含量。

3　实验结果

3.1消栓通络片与市售消栓通络片对缺血性脑损伤模型大鼠行为学评分及梗塞率的影响脑缺血后4 h，各给药组行为学评分均有降低，与模型组相比，依达拉奉组、消栓通络片高、中剂量组行为学评分均下降(P<0.01)。其余各组差异无统计学意义(P>0.05)。24 h，市售消栓通络组和消栓通络片高中剂量组大鼠行为学评分下降明显，与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)，其余各给药组分值也有下降，但与模型组相比差异无统计学意义(P>0.05)。

造模后72 h，大鼠脑梗死明显(P<0.01)，除改工艺低剂量组，其余各给药组大鼠脑梗塞率均有下降，依达拉奉组下降明显，与模型组相比差异有显著性(P<0.01)。结果见表2。

3.2消栓通络片与市售消栓通络片对血清超氧化物歧化酶SOD、NF-κB、caspase-3含量的影响造模后72 h，大鼠血清NF-κB的含量较假手术组增高(P<0.05)，给予消栓通络片高、低剂量后，能明显降低大鼠血清NF-κB含量(P<0.05)，其余各组血清NF-κB含量与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。大鼠血清caspase-3含量较假手术组增高(P<0.05)，给予消栓通络片中、高剂量后，能明显降低大鼠血清caspase-3含量(P<0.01)，其余各组血清caspase-3含量与模型组比较差异有统计学意义(P>0.05)。各组大鼠血清SOD含量在给予市售消栓通络片和消栓通络片各剂量组后与模型组比较均有明显上升(P>0.01)。结果见表3。

4　讨论

消栓通络片由川芎、丹参、黄芪、泽泻、三七、槐花、桂枝、郁金、木香、冰片、山楂十一味中药组成，君药川芎、丹参、郁金中含有水溶性酚酸类化合物[3～4]，其中原儿茶醛和咖啡酸具有广泛的抑菌、抗病毒、扩张心脑血管、抗血小板凝集作用，原儿茶醛等有强烈的清除氧自由基作用。还含有人参皂苷Rg1 、 Rb1 、三七皂苷R1 、黄芪甲苷、丹参酮等。脂溶性成分芦丁[5]属于黄酮类化合物，有明显的扩张冠脉的作用，还有抗炎、抗菌、抗病毒等作用，可用于治疗毛细血管脆性引起的出血症等。该方传统制剂工艺中黄芪、三七、槐花、丹参四味药材为水提，我们将水提工艺改为用60%醇提。制剂改进后每片含药量明显增加，服药量明显减少，增加病患用药依从性。

表2　消栓通络片与市售消栓通络片对缺血性脑损伤模型大鼠行为学评分及脑梗塞率的影响±s,n=10)

注：与空白组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.05，cP<0.01。

表3　消栓通络片与市售消栓通络片对缺血性脑损伤模型大鼠血清SOD、NF-κB、caspase-3的影响

注：与空白组比较，aP<0.05，bP<0.01；与模型组比较，cP<0.01。

我们根据文献的方法加以改进，采用MCAO的方法复制中动脉阻塞的脑缺血模型，观察改工艺后消栓通络片与市售消栓通络片对大鼠局灶性脑缺血的治疗作用差异及其作用机制。造模后72 h，我们观察到大鼠脑梗塞率达到20.64%±4.5%，且手术大鼠出现了明显的神经行为学障碍，和文献报道相符[6～7]，说明模型复制成功。给予依达拉奉后，在急性期4 h，很好缓解MCAO引起的行为学病变，降低行为学评分。给予消栓通络片与市售消栓通络片后发现，市售消栓通络片能很好缓解急性期24 h时MCAO引起的行为学病变，降低行为学评分。消栓通络片高、中剂量组能有效缓解4 h、24 h时MCAO引起的行为学病变，降低行为学评分。

Caspase家族在缺血性脑损伤中发挥重要作用，其中Caspase-3是Caspase级联反应中下游最关键的凋亡蛋白酶，在各种因素启动的凋亡程序中起最后的枢纽作用。消栓通络片高、中剂量组能明显降低MCAO引起的血清Caspase-3的升高，缓解脑缺血进展期细胞凋亡的持续发生，从而达到脑保护的作用[8～10]。NF-κB是细胞内最重要的活性蛋白转录调节因子，它调控大量基因的转录，包括细胞因子、生长因子、趋化因子、黏附因子、凋亡调控因子、炎症通路蛋白、细胞应激蛋白等。大量炎性蛋白质的表达对细胞损伤和修复过程至关重要[11-14]。消栓通络片中、低剂量组对MCAO引起的NF-κB的明显升高有一定抑制作用，从而缓解MCAO后的炎症反应及细胞凋亡的持续发展，达到脑保护作用。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，简称SOD)是清除生物体内超氧阴离子自由基的一种重要抗氧化酶[2,15]，它能降低氧化应激对脑组织产生的损伤。造模后72 h，在给予改工艺消栓通络片后SOD均有明显上升，提示改工艺消栓通络片各剂量组均有良好的抑制脑缺血后氧化应激的作用。

以上结果提示，改工艺后消栓通络片各剂量组对脑缺血恢复期大鼠均有一定的缓解作用。改工艺消栓通络片高剂量组在4 h，减轻行为学评分的作用有优于市售消栓通络片的趋势，消栓通络片高剂量组对MCAO后大鼠血清Caspase-3、NF-κB的表达均有一定的抑制作用，效果有优于市售消栓通络片的趋势。其保护作用的发挥可能依赖于对炎症及神经细胞凋亡的双重抑制作用。依达拉奉对MCAO后72 h大鼠脑梗塞率有明显的减小，说明其有较好抗脑缺血作用，而对72 h时大鼠血清SOD活性、Caspase-3、NF-κB的表达无明显影响，推测其在72 h时，对血清这三个因子影响较小，此时间点依达拉奉并不主要通过影响这三个因子的表达发挥抗脑缺血的作用。

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基金项目：现代中药创新集群与数字制药技术平台(2013ZX 09402203 )

通信作者：萧伟，男，研究员，研究方向：中药新药研发，E-mai：wzhzh-nj@163.net

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.007

(收稿日期：2016-02-13，修回日期：2016-05-08)

A comparison study of the difference in effect between adjusted XiaoShuan TongLuo and marketed XiaoShuan TongLuo Tablets on rats with focal cerebral ischemia

LI Zhuoqiong,ZONG Shaobo,ZHOU Jun,et al

(JiangsuKanionParmaceuticalCo.,Ltd.;StateKeyLaboratoryofNew-techforChineseMedicinePharmaceuticalProcess,Lianyungang,Jiangsu222001,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the difference in effect between adjusted XiaoShuan TongLuo and marketed XiaoShuan TongLuo tablets on rats with focal cerebral ischemia.MethodsRat models with middle cerebral artery occlusion(MCAO) were established.The behavior,infarction size,SOD activity,NF-κB and CASPASE-3 contents were measured.ResultsCompared with the lower dosage group,higher and middle dosage groups of XiaoShuan TongLuo(0.44 and 0.22 g·kg-1) could remarkably decrease the scales of neurological behavior of MCAO rats.All group of XiaoShuan TongLuo could obviously increase the SOD of MCAO rats remarkably，and higher and lower dosage groups of XiaoShuan TongLuo could obviously decrease the NF-κB lever of MCAO rats.Middle and lower dosage groups of XiaoShuan TongLuo could obviously decrease the CASPASE-3 level of MCAO rats.Compared with marketed XiaoShuan TongLuo tablets,adjusted XiaoShuan TongLuo was prior in the decrease of behavior evaluation,increase in SOD,and the expressions of serum Caspase-3 and NF-κB.ConclusionsEach dosage group of adjusted XiaoShuan TongLuo is helpful in the recovery of rats with cerebral ischemia,whose effect is better than marketed XiaoShuan TongLuo tablets.

Key words:TECHNOLOGY IMPROVING (TCD);Astragalus membranaceus;Panax notoginseng;FLOS SOPHORAE;Salvia miltiorrhiza;Hypoxia-Ischemia,Brain;Rats