热射病后不同时间点大鼠海马CA1区锥体细胞计数的变化①

万明胜，张云，吴士文，

热射病后不同时间点大鼠海马CA1区锥体细胞计数的变化①

万明胜1，张云2，吴士文1，2

目的观察热射病后大鼠海马组织CA1区锥体细胞数量随时间的变化。方法Sprague-Dawley大鼠分为对照组（n=5）和热射病组（n=14），后者又分为7 d、21 d两个亚组，每亚组7只。热射病组建立热射病模型，于预定各个时间点取大鼠脑组织进行尼氏染色，计数海马CA1区存活锥体细胞。结果热射病组海马CA1区锥体细胞数明显减少（F=11.80，P＜0.01），其中21 d亚组低于7 d亚组（P＜0.05）。结论热射病后海马组织CA1区锥体神经细胞随时间减少，可能是导致学习、记忆受损的原因之一。

热射病；海马；锥体细胞；大鼠

［本文著录格式］万明胜，张云，吴士文.热射病后不同时间点大鼠海马CA1区锥体细胞计数的变化［J］.中国康复理论与实践，2016，22（7）:793-796.

CITED AS:Wan MS，Zhang Y，Wu SW.Variability of pyramidal neurons in hippocampal CA1 area with time after heat stroke in rats［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（7）:793-796.

热射病（heat stroke，HS）是中暑中最为严重的类型，是指高热（核心体温＞40℃）伴神志障碍。脑是热射病早期最易受损的器官，尤以小脑和海马损害为甚。随着全球气候逐渐变暖，热浪天气频繁发生［1］，高温所致的热射病给人类健康带来严重威胁，热射病对中枢神经系统的损害具有很高的致死率和致残率。

既往已有多项研究发现，热射病后海马组织细胞数量减少，但缺乏定量研究。本课题组前期研究也发现，热射病后存在学习、记忆功能受损［2］。

本文观察热射病后不同时间大鼠海马组织CA1区锥体细胞数，探讨热射病后学习、记忆能力受损的机制，并探讨可能的评价脑组织损伤严重程度的方法。

1材料与方法

1.1主要实验试剂及仪器

戊巴比妥钠：SIGMA公司。尼氏染色液试剂盒：北京雷根生物技术有限公司。PowerLab/4SP多通道生理记录仪：ADInstruments公司。XMZ404电子温度传感器、动脉压力传感器：成都仪器厂。冰冻切片机：德国徕卡公司。DP70显微镜：OLYMPUS公司。

1.2实验动物及分组

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠19只，8周龄，体质量260～300 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2012-0001。每笼5～6只饲养，环境温度（25±0.5）℃，12 h昼夜周期，自由饮食。适应环境5 d。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

大鼠分为对照组（Sham，n=5）和热射病组（HS，n= 14），其中热射病组又分为热射病后7 d组（HS7）和热射病后21 d组（HS21），均7只。

1.3模型建立

3%戊巴比妥钠1 ml/kg腹腔注射麻醉。

Sham组股动脉插管，监测动脉压。置于温度（25± 0.5）℃、湿度25%环境中。苏醒后独笼饲养在（25± 0.5）℃动物房内，12 h昼/夜周期，自由饮食。

HS组股动脉插管，监测动脉压及直肠温度，置于温、湿度控制箱中，暴露于（39.5±0.2）℃、湿度13.5%环境中，约90～120 min，大鼠核心体温≥42℃或平均动脉压降至50 mmHg后，迅速拔出股动脉插管，予4℃凉水冲洗10 min。苏醒后独笼饲养在（25± 0.5）℃动物房内，12 h昼/夜周期，自由饮食。

1.4病理切片制备

1.4.1取材与切片

各组大鼠于预定时间，Sham组于术后第2天，予3%戊巴比妥钠1 ml/kg腹腔注射麻醉，固定于鼠板上，灌注用输液瓶高于操作台约1.5 m。大鼠左侧胸骨旁线剪开胸腔，暴露心脏和左侧胸腔，从左心室插入灌注针至主动脉根部，注意勿损伤室间隔；缝线固定针头，夹闭胸主动脉，剪开右心耳，灌入4℃预冷生理盐水约100 ml，直至大鼠眼球、双前肢变白，右心耳流出清亮灌注液体；继以4℃预冷4%多聚甲醛灌注固定约100 ml，先快后慢，至大鼠前肢、后颈部肌肉僵硬为止。断头，取出全脑，4℃4%多聚甲醛浸泡固定48 h。固定后的脑组织于视交叉与四叠体间切取4 mm脑片，20%、30%梯度蔗糖溶液脱水至沉底。OCT胶包埋，液氮预冷的异戊烷速冻，置-80℃冰箱中保存。冰冻切片机切取视神经交叉后约3 mm的海马组织，厚10 μm，贴于黏附载玻片上，室温风干，密闭置-80℃冰箱中保存以备染色。

1.4.2尼氏染色及计数

切片滴焦油紫液（试剂A）3～4滴，置湿盒中，56℃温箱中染色1 h，蒸馏水洗净染液；分化液（试剂B）中分化1～3 min，显微镜下观察至背景接近无色或浅蓝色为止；蒸馏水冲洗净分化液，无水乙醇迅速脱水，二甲苯透明，中性快干胶封片。10×40倍光镜下分别对每侧海马CA1区锥体细胞层选取3个视野（图1），每张切片获取6个视野，每只大鼠取连续3张切片，共获取18个视野。盲法用Image-Pro Plus 6.0测量每张图片中锥体细胞条带长度，人工计数细胞膜、核膜完整，核仁清楚的存活锥体细胞数，换算成锥体细胞数/mm，作为切片的计数结果。取3张切片的平均值作为每只标本的计数结果。

图1　CA1区计数框的选取方法（尼氏染色，40×）

1.5统计学分析

2结果

CA1区锥体细胞数各组间有非常显著性差异（P＜0.01）。与Sham组比较，HS7组和HS21组存活锥体细胞数目减少（P＜0.05），HS21组低于HS7组（P＜0.05）。见表1、图2。

表1　　各组海马CA1区锥体细胞数（/mm）

图2　各组海马CA1区尼氏染色（400×）

3讨论

中暑是指在高温、高湿环境下，机体产热、散热失衡，体温调节中枢功能障碍，汗腺功能衰竭和水、电解质丧失过多而出现的相关临床表现。依据发病时临床表现的不同，可将中暑分为热痉挛、热衰竭和热射病。

热射病为中暑最严重的表现。依据发病时的状态和发病机制，可将热射病分为非劳力性热射病（nonexertional heat stroke）和劳力性热射病（exertional heat stroke）。前者又称经典型热射病，是由于体温调节功能障碍，散热减少引起，常发生在炎热天气中久坐不动的人群，多数是老年人；后者是由于机体产热过多引起，常见于参加运动的人群，因此可发生于非炎热天气时。两者均具有致命性，病死率20%～70%，50岁以上人群更高达80%；劳力性热射病也是运动员第3位引起死亡的原因［3］。

热射病的定义是高热（核心体温＞40℃）伴神志障碍，中枢神经系统症状尤为突出，可出现谵妄、惊厥、昏迷、共济失调、记忆障碍等，即使经及时降温等治疗而存活的个体，也有近30%遗留永久性神经功能损害［4］；在永久性功能损害的患者中，神经功能损害占76%～100%［5-7］。

脑是热射病早期最易受损的器官。对热射病患者死后的尸检发现，脑部存在水肿、局灶性出血和点状梗死［8］；随着热打击程度加重，脑水肿加重，逐渐出现神经元变性、坏死等［9-10］，尤以小脑Purkinje细胞病变较为突出，因此常发生构音障碍、共济失调和辨距不良等小脑症状，影像学检查也可发现小脑进行性萎缩，灰白质界限不清等。

既往的临床和基础研究主要聚焦于小脑损害，对海马的损害关注较少。虽然海马组织对热打击不如小脑敏感［11］，但也存在一定程度损害，临床上可发现热射病患者存在认知功能障碍、记忆力减退、注意力不集中等，影像学也可发现热射病后海马存在异常信号［12-14］。

海马是脑参与学习、记忆功能最重要的区域，海马损伤可引起学习、记忆功能受损［15］。在海马结构中，CA1区对缺血等损伤因素具有选择易感性，而CA3区及齿状回相对稳定［16］，因此大部分对海马损伤的研究都集中在CA1区。本课题组前期的实验证明，热射病7 d后，大鼠存在学习记忆功能障碍［2］。进一步研究显示，热射病后21 d，学习、记忆能力仍低于正常，遗留有远期损害，但程度较7 d时有所好转［17］。已有研究显示，高温可致海马神经细胞损伤，主要方式是细胞凋亡［18］。本研究显示，热射病后锥体细胞数有所减少，这可能是引起认知功能损害的原因之一。研究表明，成年大鼠海马齿状回颗粒细胞终生具有生成新神经元的能力，颗粒细胞下层能产生新的颗粒细胞，形成新的突触联系，这对学习、记忆功能有至关重要的作用［19］，这也可解释热射病大鼠后期学习、记忆能力能够部分恢复的现象。

热射病对中枢神经系统造成损伤的原因主要来源于两个方面：一是高热可直接造成细胞损伤，引起酶变性、线粒体功能障碍、细胞膜稳定性丧失和有氧代谢途径中断；二是由内毒素血症、炎症因子和其他免疫介质诱发的全身炎症反应综合征对组织造成的损伤。已有多项研究也证实，白细胞介素-1α、1β，肿瘤坏死因子-α等炎症因子在热打击后显著升高［20］，这也可以解释为什么停止热打击后，组织损伤仍然继续并遗留长期后遗症。

脑缺血、缺氧是热射病主要的病理生理基础，既往对热射病中枢神经系统损伤的研究多停留在形态学观察，进行定量研究的较少，且缺乏敏感及可重复的对损伤严重程度进行评价的指标。由于健康Sprague-Dawley大鼠海马CA1区神经元排列相对均一；在遭受诸如缺血等损伤后，即使在同一CA1区，细胞密度也不均匀，计数位置的选取对结果影响较大，损伤急性期尤为明显。因此计数时不能局限在单个区域，应分散至多个区域或对整个CA1区进行计数［21］。本研究对每只大鼠脑组织同一冠状切面进行切片，减小了取材导致的个体间差异。选取7 d和21 d相当于热射病急性后期和恢复期，并分别于左、右海马CA1区随机选取多个视野，计数锥体细胞及细胞条带长度，减小了细胞密度不均一对结果的影响。这种计数办法或许可以成为一种可行的评价热射病中枢神经系统损伤严重程度的方法，同时对于干预措施效果评定的研究也有一定的意义。

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Variability of Pyramidal Neurons in Hippocampal CA1Area with Time after Heat Stroke in Rats

WAN Ming-sheng1，ZHANG Yun2，WU Shi-wen1，2
1.The Clinical College of the General Hospital of Chinese People's Armed Police Forces，Anhui Medical University，Beijing 100039，China；2.the General Hospital of Chinese People'sArmed Police Forces，Beijing 100039，China
Correspondence to WU Shi-wen.E-mail:neurowu@gmail.com

Objective To observe the pyramidal neurons in the hippocampal CA1 area varying with time after heat stroke in rats.Methods Sprague-Dawley rats were divided into sham group（n=5）and heat stroke group（n=14），and the heat stroke group was divided into 7-day subgroup and 21-day subgroup（n=7 at each group）after heat stroke.Heat stroke group was established model of heat stroke.The brain tissues of rats were observed with Nissl staining to count the living pyramidal neurons in hippocampal CA1 area.Results The number of living pyramidal neurons in hippocampal CA1 area decreased in the heat stroke group（F=11.80，P＜0.01），and decreased more in the 21-day subgroup than in the 7-day subgroup（P＜0.05）.Conclusion Pyramidal neurons in hippocampal CA1 area decrease with time after heat stroke，which may be associated with the learning and memory impairment.

heat stroke；hippocampus；pyramidal neuron；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.07.011

R594.1

A

1006-9771（2016）07-0793-04

国家发改委卫星专项基金项目（No.发改办高技［2013］2140）。

1.安徽医科大学武警总医院临床学院，北京市100039；2.武警总医院，北京市100039。作者简介：万明胜（1988-），男，汉族，湖南岳阳市人，硕士研究生，主要研究方向：热射病中枢神经系统损伤的研究。通讯作者：吴士文，男，博士，副教授、硕士研究生导师。E-mail: neurowu@gmail.com。

2016-02-03

2016-03-04）