电针预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后炎性因子及细胞凋亡的影响①

朱路文，叶涛，姜云飞，吴孝军，李宏玉，宋名扬，唐强

电针预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后炎性因子及细胞凋亡的影响①

朱路文1，叶涛2，姜云飞2，吴孝军2，李宏玉2，宋名扬2，唐强1

目的探讨电针预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后白细胞介素（IL）-1β、IL-6含量及细胞凋亡的影响。方法36只清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组和电针预处理组，每组12只。大脑中动脉阻塞（MCAO）建立脑缺血2 h再灌注模型。再灌注后24 h，酶联免疫吸附法检测血清、脑组织IL-1β、IL-6的含量，TUNEL染色检测缺血半暗区神经细胞凋亡。结果与模型组比较，电针预处理组大鼠血清、脑组织IL-1β、IL-6的含量明显下降（P＜0.01），TUNEL阳性细胞数显著下降（P＜0.001）。结论电针预处理降低炎症反应，减少细胞凋亡。

脑缺血再灌注；电针；预处理；白细胞介素-1β；白细胞介素-6；细胞凋亡；炎症反应；大鼠

［本文著录格式］朱路文，叶涛，姜云飞，等.电针预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后炎性因子及细胞凋亡的影响［J］.中国康复理论与实践，2016，22（7）:765-768.

CITED AS:Zhu LW，Ye T，Jiang YF，et al.Effects of electro-acupuncture pretreatment on interleukin-1β，interleukin-6 and apoptosis in rats after cerebral ischemia-reperfusion injury［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（7）:765-768.

脑缺血再灌注后，机体免疫系统激活，分泌白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）等炎症细胞因子，引起神经元细胞损伤与凋亡，导致脑组织结构缺失与功能障碍［1-2］。近年国内外研究证实，电针预处理可诱导脑缺血耐受，减轻脑缺血再灌注损伤，发挥脑保护作用［3-5］。本实验探讨电针预处理百会穴对脑缺血再灌注大鼠血清、脑组织IL-1β、IL-6含量及缺血半暗区细胞凋亡的影响。

1材料与方法

1.1实验动物

清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠36只，体质量220～240 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，许可证号SCXK（黑）2008001。于温度24～26℃、湿度60%～70%、噪音＜60 dB环境下饲养，明暗各12 h交替（7:00～19:00开灯）。

1.2主要仪器和试剂

G6805-1A型电针仪：上海华谊医用仪器厂。MK3酶标仪：THERMO SCIENTIFIC公司。KDC-160HR高速冷冻离心机：中科中佳科学仪器有限公司。RM2235型切片机：LEICA公司。PeriFlux 5000型激光多普勒血流仪：帕瑞医学公司。TUNEL试剂盒：ROCHE公司。IL-1β、IL-6 ELISA检测试剂盒：北京诚林生物技术有限公司。考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒：北京赛驰生物科技有限公司。

1.3动物分组及干预

将36只大鼠编1～36号。计算机生成一个含36个数的随机数字表，以表中第一数对应大鼠编号1，从左到右，自上而下分别对应1～36号大鼠。用表中随机数字除以3得余数确定各编号的组别，余数0、1、2分别对应假手术组、模型组、电针预处理组，最终各组随机分入12只大鼠。假手术组接受类似电针预处理组的各项手术操作，但不行模型制作；模型组仅接受模型制作；电针预处理组电针预处理2周后制作模型。

1.3.1电针预处理

大鼠固定于大鼠固定器上，根据《实验动物图谱》选取大鼠百会穴（双耳前缘连线中点），采用直径0.25 mm，长25 mm毫针（贵州安迪医疗器械有限公司），45°进针2 mm。连接电针仪，另一极连接耳尖，采用疏密波，频率2/15 Hz，强度1 mA，干预30 min，每天1次，每周5 d，共2周。

1.3.2模型制备

线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）再灌注模型。术前12 h禁食不禁水。10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，恒温加热板保持大鼠体温于36.5～37.5℃。碘伏颈部消毒，颈正中处切口，钝性剥离软组织，暴露颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，结扎靠近分叉处的颈总动脉和颈外动脉，颈总动脉分叉处下方用眼科剪剪一“V”型切口，将头端过蜡、直径0.26 mm的鱼线插入颈内动脉，深距离分叉处17～18 mm。激光多普勒监测血流阻闭情况，于大脑中动脉脑血流降基线值30%以下视为造模成功。结扎颈内动脉，2 h后拔出栓线。各组于再灌注2 h根据Longa等的5分制法进行神经功能缺损评分［6］，评分1、2、3分的大鼠视为造模成功，纳入实验。

1.4取材及检测方法

1.4.1血清IL-1β、IL-6含量

再灌注24 h后，各组取6只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛4 ml/kg麻醉，真空采血管于心尖采血4 ml，室温静置30 min，4℃ 3000 r/min离心15 min，取上清，保存于-20℃冰箱。严格按照试剂盒说明检测各组血清IL-1β、IL-6含量。

1.4.2脑组织IL-1β、IL-6含量

再灌注24 h后，取余下6只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛4 ml/kg麻醉，快速断头取脑，切取缺血侧脑梗死周边组织，称重后，4℃预冷PBS制备10%脑组织匀浆，4℃ 3000 r/min离心10 min，取上清，保存于-20℃冰箱。运用考马斯亮蓝法标定蛋白含量，酶联免疫吸附法测定脑组织匀浆中IL-1β、IL-6含量，除以蛋白含量后即得到每毫克组织蛋白中IL-1β、IL-6含量。

1.4.3TUNEL染色

采血结束后，动脉夹或止血钳夹闭腹主动脉或流向下肢的血管，心内灌注。冰板上快速断头取脑，保存于4%多聚甲醛中，4℃冰箱过夜。视交叉后1 mm冠状位向后切取厚4 mm脑组织，置10%中性福尔马林缓冲液中固定18 h。常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明，石蜡包埋，连续冠状切片，厚3～5 μm，烤片后4℃保存。

65℃烤片1 h，二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ、Ⅱ，各5 min），下行梯度酒精水合，室温下蛋白酶K消化30 min，PBS漂洗3次，各5 min（下同）；37℃暗湿盒中滴加TUNEL反应液50 μl，孵育1 h，PBS漂洗；37℃暗湿盒中滴加POD反应液50 μl，孵育30 min，PBS漂洗；室温下DAB显色，PBS漂洗，苏木素对比染色，温水返蓝。上行梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片，镜检。每只大鼠取1张切片，低倍镜（10×10）下定位缺血半暗区，高倍镜（10×40）下观察拍照，计数TUNEL阳性细胞数。

1.5统计学分析

2结果

2.1血清IL-1β、IL-6含量

与假手术组比较，模型组血清IL-1β、IL-6均显著升高（P＜0.001）。与模型组比较，电针预处理组血清IL-1β、IL-6含量显著降低（P＜0.001）。见表1。

2.2脑组织IL-1β、IL-6含量

与假手术组比较，模型组脑组织IL-1β、IL-6均显著升高（P＜0.001）。与模型组比较，电针预处理组脑组织IL-1β、IL-6均明显降低（P＜0.01）。见表1。

2.3TUNEL染色

假手术组少见TUNEL阳性细胞。与假手术组比较，模型组大鼠TUNEL阳性细胞数显著增加（P＜0.001）。与模型组比较，电针预处理组TUNEL阳性细胞显著减少（P＜0.001）。见表1。

表1　　各组血清和脑组织IL-1β、IL-6含量及TUNEL阳性细胞数比较

3讨论

脑缺血再灌注损伤中医学称为“中风”，由窍闭神匿，神不导气所致，治疗遵循“病变在脑，首取督脉”的理论。百会属督脉，有醒脑开窍，升阳举陷，益气补虚、平肝息风的功效。电针刺激百会穴可减轻脑缺血损伤，降低脑梗死体积，抑制细胞凋亡，促进神经功能恢复［7-9］。

电针预处理是于脑缺血前进行单次或多次电针刺激，预防及保护脑损伤的一种方法［7，10］。电针预处理可通过内质网应激途径、低氧诱导因子-1α、非受体酪氨酸激酶-信号转导和转录激活因子信号转导通路等，抑制细胞凋亡，发挥脑保护作用［8，11-12］；还可通过抗氧化应激，调节血脑屏障、内源性大麻素系统等途径，诱导脑缺血耐受［13-15］。

近年来，脑缺血再灌注后炎症反应被认为是治疗脑缺血的重要靶点。脑缺血再灌注后，可产生大量炎症因子，激活和趋化炎性细胞及合成分泌黏附因子等，多种因素相互作用引起级联反应，导致脑组织继发炎症性损伤［16］。

IL-1β、IL-6是炎症反应中的重要因子。IL-1β是炎症细胞的强烈趋化因子，可引起星形细胞、小胶质细胞活化与增多，星形胶质细胞增殖活化［17］；还可致白细胞浸润、增加兴奋性氨基酸和氧自由基的释放等，引起级联反应，使炎症反应加剧甚至失控，导致脑组织继发性损伤［18-19］。

IL-6表达水平是脑缺血再灌注损伤程度的重要指标［20］。IL-6可诱导T淋巴细胞作用于脑组织，还可引起炎症介质的生成与增多，促进基质金属蛋白酶-1表达，从而加速炎症反应，引起神经元、胶质细胞及内皮细胞受损［21-23］。

本研究显示，脑缺血再灌注24 h，可诱发炎症反应，而电针预处理可降低该炎症反应相关炎症因子，发挥抑制炎症级联反应的作用。

炎症反应与细胞凋亡在时间和空间上相互重叠、彼此影响，共同构成损伤过程中的级联反应，从而加速脑缺血再灌注损伤的出现。细胞凋亡又称细胞程序性死亡，是由细胞内外因素刺激导致细胞本身自杀程序被激活而引起。神经细胞凋亡程序在脑缺血损伤，特别是脑缺血再灌注损伤中起着重要作用［24-26］。细胞凋亡在脑缺血后所引起的迟发性神经元死亡占比较大。本研究显示，脑缺血再灌注可诱发缺血半暗带神经细胞大量凋亡，而电针预处理可降低细胞凋亡水平，减轻脑损伤程度。

总之，本研究显示，电针预处理可以有效抑制脑缺血再灌注后的炎症反应，减弱其诱导级联反应的发生，抑制损伤脑组织的细胞凋亡，从而诱导脑缺血耐受。本研究进一步证实电针预处理的脑保护作用，为电针预处理作为缺血性脑卒中的防治措施提供坚实的理论基础。

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Effects of Electro-acupuncture Pretreatment on Interleukin-1β，Interleukin-6 and Apoptosis in Rats after Cerebral Ischemia-reperfusion Injury

ZHU Lu-wen1，YE Tao2，JIANG Yun-fei2，WU Xiao-jun2，LI Hong-yu2，SONG Ming-yang2，TANG Qiang1
1.The Second Hospital Affiliated to Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin，Heilongjiang 150001，China；2.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin，Heilongjiang 150040，China
Correspondence to TANG Qiang.E-mail:tangqiang1963@163.com

Objective To investigate the effect of electro-acupuncture pretreatment on content of interleukin（IL）-1β and IL-6 in serum and ischemic penumbra，and apoptosis in ischemic penumbra in rats after cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods Thirty-six male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group（n=12），model group（n=12），and electro-acupuncture pretreatment group（n= 12）.The middle cerebral arteries were occluded for 120 minutes and reperfused.Twenty-four hours after reperfusion，the level of IL-1β and IL-6 in serum and brain tissue was detected with enzyme-linked immunosorbent，and apoptosis of ischemic penumbra was detected with TUNEL.Results The content of IL-1β and IL-6 in the serum and brain tissue，and the number of TUNEL-positive cells decreased in the electro-acupuncture pretreatment group compared with that in the model group（P＜0.01）.Conclusion Electro-acupuncture pretreatment may inhibit inflammatory response and apoptosis in cerebral ischemia-reperfusion injury.

cerebral ischemia-reperfusion；electro-acupuncture；pretreatment；interleukin-1β；interleukin-6；inflammatory response；apoptosis；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.07.005

R743.32

A

1006-9771（2016）07-0765-04

1.哈尔滨市科技创新人才专项基金项目（青年后备人）（No.2014RFQGJ150）；2.黑龙江省自然科学基金项目（No.QC2015103）；3.国家自然科学基金项目（No.81503666）。

1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨市150001；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨市150040。作者简介：朱路文（1983-），男，山东邹城市人，博士，主治医师，主要研究方向：针刺预处理预防脑血管病。通讯作者：唐强（1963-），男，四川大竹县人，教授，博士生导师，主要研究方向：中医康复基础与临床研究。E-mail:tangqiang1963@163.com。

2016-03-28

2016-05-19）