自噬对血管性痴呆大鼠海马CA1区生长相关蛋白-43及微管相关蛋白-2表达的影响①

张文彦，刘金霞，刘斌，邓春颖，张晋霞，马原源，毛文静，李世英，吕超男

专题自噬与神经功能

自噬对血管性痴呆大鼠海马CA1区生长相关蛋白-43及微管相关蛋白-2表达的影响①

张文彦，刘金霞，刘斌，邓春颖，张晋霞，马原源，毛文静，李世英，吕超男

目的探讨自噬对血管性痴呆大鼠海马CA1区突触可塑性相关蛋白生长相关蛋白-43（GAP-43）和微管相关蛋白-2 （MAP-2）表达的影响。方法96只健康雄性Sprague-Dawley大鼠，随机分为假手术组（Sham组）、血管性痴呆模型组（VD组）、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤预处理组（3-MA组）和自噬激动剂雷帕霉素预处理组（Rap组）。每组又分为模型制备成功后1周、2周、4周、8周四个亚组，每个亚组6只。应用改良Pulsinelli四血管阻断法制备血管性痴呆模型。采用免疫组化法检测大鼠海马CA1区GAP-43、MAP-2蛋白的表达。结果与Sham组比较，VD组各时间点GAP-43蛋白表达明显增加（P＜0.01），MAP-2蛋白表达明显减少（P＜0.01）；与VD组比较，3-MA组各时间点GAP-43、MAP-2蛋白表达水平增加（P＜0.05），Rap组各时间点GAP-43、MAP-2蛋白表达水平降低（P＜0.05）。结论自噬抑制血管性痴呆大鼠海马CA1区突触可塑性相关蛋白GAP-43、MAP-2表达，抑制自噬可能有利于血管性痴呆大鼠海马CA1区神经突触重塑。

血管性痴呆；自噬；生长相关蛋白-43；微管相关蛋白-2；突触可塑性；大鼠

［本文著录格式］张文彦，刘金霞，刘斌，等.自噬对血管性痴呆大鼠海马CA1区生长相关蛋白-43及微管相关蛋白-2表达的影响［J］.中国康复理论与实践，2016，22（7）:745-749.

CITED AS:Zhang WY，Liu JX，Liu B，et al.Effects of autophagy on expression of growth-associated protein-43 and microtubule associated protein-2 in CA1 area of hippocampus of vascular dementia rats［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（7）:745-749.

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是指由脑血管性因素造成，临床表现为智力减退、认知功能障碍的一种临床综合征，病程呈缓慢进展，是老年期痴呆常见病因之一［1-2］。慢性缺血缺氧和低灌注是VD的重要原因，有关自噬激活和突触可塑性损伤等观点在VD发病中所发挥的作用越来越受国内外学者的关注。我们的前期研究显示，自噬和突触可塑性相关蛋白在VD的发病中有重要作用［3-4］。生长相关蛋白-43 （growth-associated protein-43，GAP-43）和微管相关蛋白-2（microtubule associated protein-2，MAP-2）是神经元重塑的常用分子标志物［5-6］。本研究探讨自噬对VD大鼠海马CA1区GAP-43和MAP-2表达的影响。

1材料与方法

1.1实验动物

清洁级健康雄性Sprague-Dawley大鼠96只，月龄2～3个月，体质量240～260 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号SCXK（京）2013-0013。在华北理工大学屏障环境动物实验室自由进食喂养，室温（24±2）℃，自然光照，实验前适应喂养2周。

1.2主要试剂

兔抗大鼠GAP-43多克隆抗体、兔抗大鼠MAP-2多克隆抗体和山羊血清封闭液：北京博奥森生物技术有限公司。柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、SP免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3主要仪器

脑立体定位仪：NARISHIGE公司。光学显微镜：OLYMPUS公司。动物电凝仪：张家港市航天医疗电器有限公司。组织切片机：德国LEITZ公司。

1.4动物分组

将大鼠编号，随机数生成器随机抽取不同数字，将大鼠分为假手术组（Sham组）、VD模型组（VD组）、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）预处理组（3-MA组）和自噬激动剂雷帕霉素预处理组（Rap组）。每组又分为模型制备成功后1周、2周、4周、8 周4个亚组，每个亚组6只大鼠。

1.5模型制备及处理

采用改良Pulsinelli四血管阻断（4-VO）法制备VD大鼠模型［7］。VD组10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉。电凝针烧灼双侧C1横突孔内椎动脉，使其永久闭塞。消毒、缝合。分离双侧颈总动脉，并穿线备用。24 h后，动脉夹夹闭双侧颈总动脉，每次5 min，间隔10 min，反复3次。观察到大鼠四肢及尾巴僵硬，尾巴向上强直卷曲，翻正反射消失。

3-MA组麻醉后，将鼠头固定于立体定向仪上，切开头皮，分离皮下组织，蘸少量10%双氧水擦拭颅骨以充分暴露前囟的“十字交叉”骨性结构。侧脑室立体定位［8］：颅骨前囟门点（Bregma点）旁开0.9 mm，向后1.5 mm，并标记。微型牙科钻将颅骨缓缓钻透，有明显穿透感后拔出，到达硬脑膜表面即可。微量进样器抽吸10 mmol/L 3-MA溶液6µl，沿钻孔缓慢进针，深3.8 mm，5 min内匀速缓慢注完，留针5 min后缓慢拔针。侧脑室注射完毕后同VD组造模。

Rap组同3-MA组注射8 ng/µl雷帕霉素溶液4µl。同法造模。

Sham组只暴露双侧颈总动脉及第1颈椎横突孔，不进行椎动脉电凝及颈总动脉夹闭。

术后，大鼠均予以腹腔注射庆大霉素1万U/kg，共3 d，以预防感染。

行Morris水迷宫测试，观察大鼠穿越平台次数，筛选出造模成功的大鼠［3，9］。术后4周左右，大鼠出现VD行为学改变，其中5只由于病情过重淘汰，另有3只死亡，均给予相应补充。

1.6免疫组织化学染色

各组大鼠于术后预定时间点取材。腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉，仰卧固定于操作台上。剑突下剪开胸腔，充分暴露心脏，灌注针从心尖插入至左心室并固定针尖位置；剪开右心耳，注射生理盐水约250 ml，待大鼠肝脏无明显血色、右心耳流出清凉液体后，灌注4%多聚甲醛溶液约180 ml，见大鼠肢体抽动、尾巴僵直，快速断脑，迅速剥离脑组织置多聚甲醛溶液中，4℃冰箱放置24～36 h；切取视交叉前后3 mm脑组织脱水、透明、浸蜡包埋。石蜡切片机连续切片，厚约5 μm，用经泡酸、冲水、烤干、多聚赖氨酸溶液处理后的载玻片捞片，晾干后60℃烤箱中24～36 h备用。

取制备好的组织标本，加入正常羊血清封闭液中，分别滴加兔抗大鼠GAP-43多克隆抗体（1∶600）及兔抗大鼠MAP-2多克隆抗体（1∶300），4℃过夜；PBS液冲洗，滴加二抗37℃温箱孵育1 h；PBS液冲洗，DAB显色。操作步骤严格按试剂说明书进行。

镜下细胞内GAP-43、MAP-2蛋白被染成棕黄色或浅黄色颗粒，位于胞浆。高倍镜下随机选取大鼠海马CA1区6个视野，进行GAP-43、MAP-2蛋白阳性细胞计数，取平均数。

1.7统计学分析

所得数据以Excel软件建库，用SPSS 17.0统计软件进行分析。计量资料以（±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。显著性水平α=0.05。

2结果

2.1GAP-43

Sham组可见散在GAP-43阳性细胞，表达于胞浆及突起。VD组1周时可见较多GAP-43阳性表达细胞，随着时间延长逐渐减少，8周时最少；与Sham组比较，VD组各时间点GAP-43阳性细胞数均明显增加（P＜0.01）。与VD组比较，3-MA组各时间点GAP-43阳性细胞数增加（P＜0.05），Rap组各时间点GAP-43阳性细胞数减少（P＜0.05）。见图1、表1。

2.2MAP-2

Sham组可见MAP-2阳性细胞表达于胞浆及突起。VD组1周时可见较少MAP-2阳性表达，随着时间的延长逐渐增强，4周达到高峰，8周开始减少；与Sham组比较，VD组各时间点MAP-2阳性细胞数均明显减少（P＜0.01）。与VD组比较，3-MA组各时间点MAP-2阳性细胞数增加（P＜0.05），Rap组各时间点MAP-2阳性细胞数减少（P＜0.01）。见图2、表2。

图1　　各组大鼠海马CA1区GAP-43表达（免疫组化染色，400×）

表1　　各组不同时间点GAP-43阳性细胞数（/高倍视野）

表2　　各组不同时间点MAP-2阳性细胞数（/高倍视野）

3讨论

自噬是存在于真核细胞中的生命现象，是细胞维持稳态和对不良环境的一种防御机制，参与清除细胞废物、结构重建和生长分化等［10-11］；自噬也参与诸如VD等多种疾病的病理过程［3-4，12］，无论是自噬过度还是不足都可导致疾病发生。

突触是实现神经元信息传递的基本结构单位，其形态、数量的改变即为突触可塑性。突触可塑性是神经系统生长发育、损伤修复及学习记忆等活动的神经生物学基础［13-14］。GAP-43和MAP-2是神经元重塑的常用分子标志物。

GAP-43含有226～243个氨基酸，又被称B50、F1、PP46、神经调素，存在于突触前膜、生长锥、胞浆中，可通过与膜脂肪酸共价连接而与神经元膜结合，可从生长锥或突触膜表面伸展开来，可逆地附着在膜表面；又可与胞质及细胞结构蛋白相互作用［15］。GAP-43是神经元特异性突触前膜蛋白，作为神经再生的标志，是神经元生长期的内在决定因子［16］；在损伤后主要通过侧支出芽等方式进行结构重塑［17］；其表达与成年动物神经元轴突再生及可塑性密切相关［18］，发挥突触可塑性的调节作用。

MAP-2属于结构性微管相关蛋白家族，是一种高度保守的热稳定磷蛋白，主要存在于中枢神经系统神经元胞体和树突［19］，在神经元发育早期和成年后突触构成期表达，调节微管的可逆性聚合作用及其稳定性［20］。MAP-2在维持神经元及突触的正常形态结构和功能过程中起重要作用，参与突触可塑性调节。

自噬及突触可塑性相关蛋白在VD的发病中均有重要作用［3-4］，但自噬与突触可塑性之间在VD发病中是否存在关联，目前文献报道较少。3-MA是一种常用的细胞自噬抑制剂［21］，能通过抑制自噬体形成过程中的三型磷脂酰肌醇激酶3（PI3K）抑制自噬体形成。雷帕霉素是一种新型免疫抑制剂，能与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）特异性结合，抑制mTOR的蛋白激酶活性，诱导自噬发生［22］。

本研究显示，自噬对VD大鼠海马CA1区突触可塑性相关蛋白GAP-43、MAP-2表达可能具有抑制作用，抑制自噬有利于VD大鼠海马CA1区神经突触重塑。

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Effects of Autophagy on Expression of Growth-associated Protein-43 and Microtubule Associated Protein-2 in CA1Area of Hippocampus of Vascular Dementia Rats

ZHANG Wen-yan，LIU Jin-xia，LIU Bin，DENG Chun-ying，ZHANG Jin-xia，MA Yuan-yuan，MAO Wen-jing，LI Shi-ying，LÜ Chao-nan
First Department of Neurology，the Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology，Tangshan，Hebei 063000，China
Correspondence to LIU Bin.E-mail:liubintsh@126.com

Objective To observe the effects of autophagy on the expression of synaptic plasticity related protein，growth-associated protein-43（GAP-43）and microtubule associated protein-2（MAP-2），in CA1 area of hippocampus of vascular dementia rats.Methods Ninety-six healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group，vascular dementia model group（VD group），autophagy inhibitor 3-methyl adenine preconditioning group（3-MA group）and autophagy agonist rapamycin preconditioning group（Rap group）.Each group was divided randomly into subgroups of one week，two weeks，four weeks and eight weeks after modeling，six rats in each group.The vascular dementia rat model was established with modified Pulsineli's four-vessel occlusion.The expression of GAP-43 and MAP-2 in CA1 area of hippocampus were detected with immunohistochemistry.Results Compared with the sham group，the expression of GAP-43 protein increased，and the expression of MAP-2 protein decreased at every time point in VD group（P＜0.01）.Compared with VD group，the expression of both GAP-43 and MAP-2 increased in 3-MA group（P＜0.05），and decreased in Rap group（P＜0.05）.Conclusion Autophagy may inhibit the expression of synaptic plasticity related protein，GAP-43 and MAP-2，in CA1 area of hippocampus in vascular dementia rats，indicating inhibition of autophagy may promote synaptic remodeling.

vascular dementia；autophagy；growth-associated protein-43；microtubule associated protein-2；synaptic plasticity；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.07.001

R743

A

1006-9771（2016）07-0745-05

1.河北省高等学校科学技术研究重点项目（No.ZH2012046）；2.河北省级重大医学科研课题（No.zd2013087）。

华北理工大学附属医院神经内一科，河北唐山市063000。作者简介：张文彦（1974-），女，汉族，河北唐山市人，硕士，主治医师，主要研究方向：脑血管病。通讯作者：刘斌，男，硕士，主任医师，教授，研究生导师。E-mail:liubintsh@126.com。

2016-03-15

2016-04-22）