毛蕊异黄酮抗肝星状细胞活化的作用机制研究

任　爽,张　杰

(中国医科大学附属第一医院， 辽宁 沈阳 110001)



论著

毛蕊异黄酮抗肝星状细胞活化的作用机制研究

任爽,张杰

(中国医科大学附属第一医院， 辽宁 沈阳 110001)

[摘要]目的观察毛蕊异黄酮对TGF-β1/Smads信号通路的影响，探讨毛蕊异黄酮抗肝星状细胞活化的作用机制。方法以人肝星状细胞株(LX-2)为研究对象，采用高内涵系统观察细胞增殖 (EdU)及细胞内F-actin骨架的聚合情况，RT-PCR法检测细胞I型胶原(Col-Ⅰ)、α-SMA、 TGF-β1 mRNA表达水平，Wstern-blot法检测细胞内p-Smad2、Smad2及Smad7蛋白表达水平。结果TGF-β1可显著促进LX-2细胞增殖、活化，EdU阳染细胞明显增加，α-SMA、TGF-β1、p-Smad2及Col-Ⅰ mRNA 或蛋白表达显著增加(P均<0.05)，Smad7表达显著下降；毛蕊异黄酮可显著降低TGF-β1诱导的LX-2中EdU阳染细胞率以及α-SMA、p-Smad2与 Col-Ⅰ的mRNA或蛋白表达(P均<0.05)，显著提高Smad7蛋白表达，且作用与TβRI激酶抑制剂SB-431542相当。结论毛蕊异黄酮可显著抑制肝星状细胞活化，其机制与抑制TGF-β1、p-Smad2的表达，提高Smad7蛋白表达，进而抑制TGF-β1/Smads信号转导有关。

[关键词]毛蕊异黄酮，肝纤维化，肝星状细胞，TGF-β1/Smads 信号通路

肝纤维化是组织损伤导致的愈合反应，是诸多慢性肝病发展为肝硬化的重要病理过程。现代分子生物学研究发现，肝星状细胞(HSC)的活化及表型改变是其核心事件，转化生长因子(TGF)-β1是致纤维化的关键细胞因子。TGF-β1的生物学效应是通过其激活的下游信号如Smads蛋白转导通路，其作用于靶基因，能促进胶原的合成[1]。黄芪是一味常用的传统中药，其可用于治疗各类慢性肝病，而毛蕊异黄酮(CA)是从黄芪中提取的单体成分，被认为是黄芪黄酮类主要活性成分，其具有明确的抗氧化作用[2-3]。本研究以人肝星状细胞株LX-2为研究对象，观察CA对肝星状细胞活化的影响，旨在阐释其调控TGF-β1/Smads信号通路的作用机制。

1实验资料

1.1细胞人肝星状细胞株LX-2 获赠于上海中医药大学。

1.2药物CA为西安鸿生生物技术有限公司产品，含量≥90%，采用中药指纹图谱质量监控技术控制质量。

1.3主要试剂转化生长因子受体(TβR)-Ⅰ激酶抑制剂 SB-431542, 购自TOCRIS Bioscience(USA)；重组人TGF-β1(reconstituted with sterile 4 mmol/L HCl containing 1 mg/mL BSA toa final concentration of 1 μg/mL) 购自R&D Systems(USA)； DMEM培养基及胎牛血清购自Gibico(USA)；EDU细胞增殖试剂盒，购自广州锐博科技有限公司；兔单克隆I型胶原抗体,购自SIGMA-ALDRICH(USA)；兔单克隆抗体抗磷酸化Smad2、Smad2,购自CST公司(USA)；兔单克隆抗体抗Smad7抗体,购自Epetomics；RNA提取试剂盒及First strand cDNA 合成试剂盒,购自Fermentas, St. Leon-Roth(德国)；SYBR Green Real Time PCR 试剂盒,购自TakaRa Biotech(日本)； RT-PCR引物序列由大连宝生物设计合成。

1.4方法

1.4.1细胞培养与处理LX-2细胞培养于5% CO2、湿度95%、10%FBS/高糖DMEM,18 h后更换为含0.5%血清的DMEM孵育。

1.4.2细胞活力检测实验分为对照组及CA 30，60，120，240，480 μmol/L组。将1.4.1正常培养18 h后的LX-2细胞5 000个/孔接种于96孔板，对照组培养液为0.5%FBS/DMEM，CA各组加入不同浓度的CA药液，经过24 h孵育后，弃培养液，加入0.5 mg/mL MTT液，孵育4 h，小心吸弃工作液，加入DMSO 100 μL/孔至充分溶解，于酶标仪490 nm吸收波长检测吸光值。

1.4.3高内涵多指标细胞毒性检测实验分为对照组及CA 30，60，120，240 μmol/L组。将1.4.1正常培养18 h后的LX-2 细胞5 000个/孔接种于96孔板，对照组培养液为0.5%FBS/DMEM，CA各组加入不同浓度的CA药液，经过24 h孵育后，弃培养上清，每孔加入40 μL预热(37 ℃)的通透性染液，置于细胞培养箱中孵育30 min。吸弃通透性染液，每孔加入50 μL预热的4%甲醛固定液，室温下置通风柜内固定15 min。吸弃固定液，PBS洗涤2次，每孔加50 μL细胞核染液室温避光孵育5 min，吸弃染核液，PBS洗涤2次，每孔加入200 μL PBS，ArrayScan VTI HCS Reader采集图像，Multiparameter Cytotoxicity Bio Application Software对图像进行分析。

1.4.4高内涵EdU掺入法细胞增殖检测实验分为对照组、TGF-β1(2.5 ng/mL)组、TGF-β1(2.5 ng/mL)+CA 30 μmol/L组、TGF-β1(2.5 ng/mL)+ CA 60 μmol/L组、TGF-β1(2.5 ng/mL)+ CA 120 μmol/L组。将1.4.1正常培养18 h后的LX-2 细胞5 000个/孔接种于96孔板，在相应条件下孵育24 h后，弃培养液，每孔加入50 μmol/L EdU溶液100 μL孵育2 h，4%多聚甲醛固定15 min，0.2%甘氨酸孵育10 min，PBS洗5 min×2次，0.5% Triton X-100透化10 min，PBS洗5 min，Appllo ®染色反应液避光孵育30 min，PBS洗5 min，0.5% Triton X-100 孵育10 min×3次，Hoechst避光孵育10 min，PBS洗5 min×2次，ArrayScan VTI HCS Reader采集图像，Cell Health Profiling BioApplication Software 对图像进行分析。

1.4.5高内涵细胞免疫荧光染色实验分组同1.4.4，孵育结束后，弃培养液，每孔加入50 μL 4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS洗涤，以0.5% Triton X-100 孵育10 min，F-actin 染色37 ℃孵育1 h，PBS洗涤后，滴加DAPI染核5 min，PBS洗涤，ArrayScan VTI HCS Reader采集图像，Cell Health Profiling BioApplication Software 对图像进行分析。

1.4.6LX-2细胞中α-SMA mRNA、Col-Ⅰ mRNA和TGF-β1mRNA表达检测采用Real-time PCR法检测。实验分为对照组、TGF-β1(2.5 ng/mL)组、TGF-β1(2.5 ng/mL)+ CA(120 μmol/L)组、TGF-β1(2.5 ng/mL) + SB-431542(10 μmol/L)组，各组LX-2细胞在相应条件下培养24 h后，参照RNeasy Mini Kit操作说明提取RNA，检测RNA浓度及完整性，按照逆转录试剂盒说明书进行cDNA 合成，-20 ℃保存备用。Real-time PCR在Rotor-Gene 3000或ABI完成，PCR反应体系为cDNA 1 μL，SYBR Green 10 μL，引物2 μL，双蒸水7 μL。反应条件为95 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，40个循环。

1.4.7LX-2细胞中p-Smad2、Smad2、Smad7蛋白表达检测采用Wstern-blot法检测。实验分组同1.4.6，各组LX-2细胞在相应条件下培养24 h后采用RIPA缓冲液裂解，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清液，采用十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶(浓度8%～10%)电泳，转移至硝酸纤维膜。5%脱脂奶粉封闭，第一抗体4 ℃孵育过夜，红外染料标记的第二抗体室温下孵育1 h，采用Odyssey红外扫描仪扫描、分析蛋白条带。

2结果

2.1CA对LX-2细胞活力的影响MTT实验检测显示，与对照组相比，240 μmol/L和480 μmol/L CA对细胞增殖具有显著抑制作用(P均<0.05)，提示两浓度可能对细胞具有毒性作用。见图1。

2.2CA对LX-2细胞毒性的影响CA 240 μmol/L组孵育24 h细胞膜通透性明显高于对照组(P<0.05)，提示有细胞毒性；而CA其他组细胞膜通透性与对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05)，表明对细胞无毒性作用 。见图2。

2.3CA对LX-2细胞增殖的影响TGF-β1可显著促进LX-2细胞的增殖，EdU阳染细胞比率明显高于对照组(P<0.05)；而TGF-β1+ CA 120 μmol/L组EdU阳染细胞比率显著低于TGF-β1组(P<0.05)，提示120 μmol/L CA 可以显著抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞增殖。见图3～8。

2.4CA对LX-2细胞表达F-actin的影响高内涵检测见到，LX-2在TGF-β1的刺激下，其细胞内F-actin聚合成粗大的纤维束，沿细胞长轴平行排列，分布均匀，呈明显活化状态；而TGF-β1+ CA120 μmol/L组F-actin染色明显变淡、模糊，分布不均，见图 9～13。各组骨架平均荧光值变化与图片观测趋势一致，见图14。提示TGF-β1诱导了明显的LX-2活化，而120 μmol/L CA可以有效抑制TGF-β1引起的LX-2活化。

图1　各组LX-2 细胞活力

图2　各组LX-2 细胞膜通透性

图3　各组LX-2 细胞增殖情况

图4　对照组LX-2细胞增殖染色表现

图5　TGF-β1组LX-2细胞增殖染色表现

图6　TGF-β1+ CA 120 μmol/L组LX-2细胞增殖染色表现

图7　TGF-β1+ CA 60 μmol/L组LX-2细胞增殖染色表现

图8　TGF-β1+ CA 30 μmol/L组LX-2细胞增殖染色表现

图9　对照组LX-2细胞中F-actin表达情况

2.5CA对TGF-β1诱导LX-2细胞表达α-SMA、Col-Ⅰ 和TGF-β1mRNA的影响TGF-β1组α-SMA mRNA、Col-Ⅰ mRNA和TGF-β1mRNA表达量均明显高于对照组(P均<0.05)，TGF-β1+ CA 120 μmol/L组α-SMA mRNA、Col-Ⅰ mRNA和TGF-β1mRNA表达量均明显低于TGF-β1组(P均<0.05)，与SB-431542组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图15～17。

图10　TGF-β1组LX-2细胞中F-actin表达情况

图11　TGF-β1+ CA 120 μmol/L组LX-2细胞中

图12　TGF-β1+ CA 60 μmol/L组LX-2细胞中F-actin表达情况

图13　TGF-β1+ CA 30μmol/L组LX-2细胞中F-actin表达情况

2.6CA对LX-2细胞中p-Smad2、Smad2及Smad7蛋白表达的影响各组Smad2蛋白表达量比较差异无统计学意义，但TGF-β1可显著促进p-Smad2蛋白表达，引起Smad7的蛋白表达下调；120 μmol/L CA和SB-431542可以显著抑制p-Smad2蛋白的表达，显著提高Smad7蛋白的表达。见图18。

图14　各组骨架平均荧光值

图15　各组LX-2细胞中α-SMA mRNA表达量

图16　各组LX-2细胞中Col-Ⅰ mRNA表达量

图17　各组LX-2细胞中TGF-β1 mRNA表达量

3讨论

肝纤维化指肝纤维组织弥漫性增生，抑制肝纤维化可以有效防治肝硬化、肝癌的发生。肝星状细胞的活化在肝纤维化进展中发挥着重要作用，活化的肝星状细胞是肝纤维化中ECM的主要来源。抑制肝星状细胞的激活、增殖及胶原合成，对肝纤维化防治有重要价值[4-7]。F-actin可反映肝星状细胞活化程度，而α-SMA和Col-Ⅰ表达增加提示肝星状细胞活化、肝纤维进展。

图18　各组LX-2细胞中p-Smad2、Smad2及Smad7蛋白表达情况

TGF-β1是肝纤维化发生的重要刺激因子，促进肝星状细胞的活化，而TGF-β1生物效应的发挥必须通过特定的信号转导过程，该过程已基本明了。TGF-β1胞外激活后，与其胞膜上特异性受体(TGF-β type Ⅰ/Ⅱ Receptor,TβRⅠ/Ⅱ)结合，继而主要由 Smad蛋白介导胞内信号传递。Smad蛋白分为3类：①受体调控型，与TGF-β1信号转导相关的是Smad2/3；②共同型，主要是Smad 4；③抑制型， Smad7等。Smad2/3是TβRⅠ型受体胞内激酶的特异性底物，经受体激酶磷酸化后与Smad 4结合，转位细胞核内，调控细胞目的基因表达，在TGF-β1胞内信号转导中起关键作用。Smad7作为该通路负性调控因子，主要通过与TβR-Ⅰ结合，阻止Smad蛋白的磷酸化，进而抑制了TGF-β/Smad通路的信号传导[8-9]。

目前尚缺乏有效的抗肝纤维化化学药物[10]。中医药治疗慢性肝病具有悠久的历史，已经有大量体内体外研究表明中药复方或者中药提取物可以有效对抗肝纤维化。而采用效应跟踪、从复方及药物化学组分及成分的角度探索复方物质基础是当前该领域的重要研究思路之一[11]。黄芪汤(《普济本事方》)又名黄芪六一汤(《太平惠民和剂局方》)，由黄芪、甘草、大枣3味药组成，治诸虚不足、肢体劳倦、心中烦悸、唇口干渴、食少面黄，该方作为一古典方剂，广泛应用于慢性肝病的治疗中；多中心、随机、双盲、对照试验以及动物实验均提示其良好的抗肝纤维化作用[12-15]。本研究采用体外实验，以TGF-β1刺激LX-2星状细胞活化模型，应用SB-431542这一特异性TβR-Ⅰ激酶抑制剂作为阳性对照，选用有效且无毒剂量的CA(120 μmol/L)作为干预因素，实验结果提示CA和SB-431542可以有效抑制TGF-β1引起的LX-2的增殖、活化，即下调EdU阳染细胞率及a-SMA、F-actin和Col-Ⅰ表达；显著抑制TGF-β1、p-Smad2的表达，提高Smad7表达，提示CA影响TGF-β1刺激星状细胞活化与抗纤维化的主要机制在于抑制TGFβ/Smads信号通路的转导。本实验虽已了解CA干预TGFβ/Smads信号通路转导的部分重要作用，但是对于CA通过何种途径抑制TGFβ1mRNA的转录，是否影响TGF-β1胞外激活与HSCs信号跨膜以及HSCs胞内其他信号分子等，尚需进一步研究，以期系统明确CA干预TGF-β1/Smads信号转导的抗肝纤维化的关键作用机制。

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[作者简介]任爽，女，博士，主治医师，研究方向为中医药抗肝纤维化基础与临床。 [通信作者]张杰，E-mail:zhangjie945@126.com

[基金项目]辽宁省科学技术厅自然科学基金项目(201202262)；辽宁省名老中医药专家传承工作室建设项目

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.21.001

[中图分类号]R-33

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)21-2281-05

[收稿日期]2016-02-15

Study on the mechanism of Calycosin in inhibition of hepatic stellate cell activation

REN Shuang, ZHANG Jie

(The First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning, China)

Abstract:Objective It is to observe the influence of Calycosin (CA) in the signaling pathway of TGF- β1/Smads, and investigate its mechanism of action in inhibition of hepatic stellate cell activation. Methods Human hepatic stellate cell line LX-2 cells were taken as the research object, the high content system was used to observe the cell proliferation (EdU) and the aggregation of F-actin skeleton in the cell, RT-PCR method was used to detect the mRNA expression levels of collagen type I (Col-Ⅰ), α-SMA and TGF-β1, Wstern-blot method was used to detect the protein expression levels of p-Smad2, Smad2 and Smad7 in the cell. Results Compared to the control, the proliferation and activation of LX-2 was significantly promoted by TGF-β1, and the expression of mRNA or protein of EdU, F-action, α-SMA, TGF-β1, p-Smad2, Col-Ⅰ were significantly increased (all P<0.05), as well as the Smad7 was significantly decreased (P<0.05). The rate of EdU positive cells in LX-2 induced by TGF-β1 and the mRNA or protein expression of α-SMA, p-Smad2 and Col-Ⅰ were significantly reduced by CA (all P<0.05), and the expression of Smad7 protein was significantly increased (P<0.05), and the role was equivalent to TβRI kinase inhibitor SB-431542. Conclusion CA can significantly inhibit the activation of hepatic stellate cells, the mechanism is related to inhibiting the expression of TGF-β1 and p-Smad2, enhancing the expression of Smad7 protein, and then inhibiting the signal transduction of TGF-β1/Smads.

Key words:Calycosin; liver fibrosis; hepatic stellate cell; signaling pathway of TGF-β1/Smads