胰腺癌缺失基因DPC4在牙龈癌中的表达

张 强，刘继刚，杨国海，刘 江，刘 昊

胰腺癌缺失基因DPC4在牙龈癌中的表达

张 强1，刘继刚2，杨国海3，刘 江4，刘 昊5

应用免疫组织化学技术和Real-time PCR法检测33例牙龈癌（高分化15例，中分化10例，低分化8例）和8例正常牙龈组织中DPC4蛋白和mRNA的表达情况。结果显示，牙龈癌组织DPC4阳性细胞百分比显著低于正常牙龈组织，高分化、中分化、低分化牙龈癌和牙龈组织的DPC4蛋白相对表达、mRNA表达差异有统计学意义（P＜0.05）。提示牙龈癌DPC4表达降低，可能与牙龈癌的发生与发展有关。关键词胰腺癌缺失基因4；牙龈癌；免疫组织化学；Realtime PCR

网络出版时间：2016-3-8 8：29：02 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.066.htm l

牙龈癌有较高的发病、转移和复发率，绝大多数为高分化的鳞状上皮细胞癌［1］。研究与牙龈癌的发生、转移、预后有关的生物学指标将有助于合理应用综合性治疗方法，提高患者的生存率及生存质量。胰腺癌缺失基因4（deleted in pancreatic cancer 4，DPC-4）是最近几年在胰腺癌中发现的一种新型肿瘤抑制基因，其主要作用为调节细胞的生长、分化、凋亡［2-4］。研究DPC-4基因和蛋白在牙龈癌不同类型中表达、分布及变化情况，有助于为临床检测牙龈癌进行早期确诊和制定合理的治疗方案提供参考和借鉴的指标。

1 材料与方法

1.1 材料 牙龈癌组织石蜡标本来自华北理工大学附属医院口腔颌面外科，共33例，其中高分化15例，中分化10例，低分化8例。所有病例经病理学确诊，术前未进行放疗化疗。正常牙龈组织8例，为随机从癌旁牙龈组织中获取。鼠抗DPC4抗体和PCR相关试剂购自武汉博士德生物工程有限公司；免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学检测 石蜡切片常规脱蜡至水，3%H2O2溶液室温封闭内源性过氧化物酶活性，抗原热修复和5%BSA封闭后，一抗4℃孵育过夜（一抗浓度为1∶150），DAB显色。DPC4以细胞胞质和（或）细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性表达。高倍镜下，随机选择10个视野，计算阳性细胞数占视野总细胞数的平均百分比。同时应用Image-Proplus6.0软件分析系统对其阳性细胞表达的光密度进行定量分析，测定其积分光密度（integral optical density，IOD）值。

1.2.2 Real-time PCR法检测 提取石蜡组织DNA，进行 PCR扩增。DPC-4上游引物5′-AGGCTAACTCATCTGGATCG-3′，下 游引 物：5′-GCCACTTCCGCATTACCTG-3′。PCR扩增条件：94℃、4 min；94℃、30 s；55℃、30 s；72℃、25 s；35个循环。按照公式ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（管家基因）、ΔΔCt=ΔCt（实验组）-ΔCt（对照组），计算2-ΔΔCt（mRNA表达水平）。

1.3 统计学处理 采用SPSS 15.0软件进行分析，DPC4蛋白和mRNA表达比较采用单因素方差分析和LSD检验。

图1 牙龈癌及牙龈组织　DPC-4的表达 SP×400A：正常牙龈组；B：高分化组；C：中分化组；D：低分化组

2 结果

2.1 DPC4在正常牙龈组织和牙龈癌组织中的表达 DPC4基因编码的蛋白在正常牙龈组织和牙龈癌组织中主要定位在细胞质和细胞核，呈棕黄色、弥散分布，见图1、表1。经方差分析和组间两两比较显示，DPC4在各组间的表达差异均有统计学意义（P＜0.05）。正常牙龈组织中表达最高，牙龈癌组织分化程度越低，DPC4表达越低。见表2。

表1 牙龈癌及正常牙龈组织　DPC4阳性细胞百分比的比较（%，±s）

表1 牙龈癌及正常牙龈组织　DPC4阳性细胞百分比的比较（%，±s）

与正常牙龈组比较：*P＜0.05；与高分化组比较：#P＜0.05；与中分化组比较：△P＜0.05

组别　n　阳性细胞百分比（%）正常牙龈91.25±10.33高分化　15　64.63±7.18*中分化　10　47.02±5.62*#低分化　8　25.28±4.88*#△8

2.2 DPC4 m RNA在正常牙龈组织和牙龈癌组织中的表达 正常牙龈组织、高分化、中分化和低分化组牙龈癌组DPC4 mRNA相对表达量组间差异有统计学意义（P＜0.001）。牙龈癌组织DPC4 mRNA表达明显低于正常牙龈组织（P＜0.05），中分化组和低分化组均低于高分化组（P＜0.05）。见表2。

3 讨论

牙龈癌是常见的口腔颌面部恶性肿瘤之一，绝大多数为高分化的鳞状上皮细胞癌，目前其分子生物学行为机制还不是很清楚。对于牙龈癌的治疗目前以手术切除为主。但手术治疗会造成患者颜面部的缺损和畸形，给患者生理和心理上带来极大的痛苦。因此研究与牙龈癌的发生、转移、预后有关的生物学指标将有助于合理应用综合性治疗方法，提高患者的生存率及生存质量。

表2 不同分化类型牙龈癌组织中　DPC4蛋白和　mRNA表达（±s）

表2 不同分化类型牙龈癌组织中　DPC4蛋白和　mRNA表达（±s）

与正常牙龈组比较：*P＜0.05；与高分化组比较：#P＜0.05；与中分化组比较：△P＜0.05

组别　n　蛋白mRNA正常牙龈8　21.64±3.17　1.00±0.00高分化　15　13.47±1.25*　0.74±0.10*中分化　10　9.33±1.00*#　0.51±0.03*#低分化　8　2.42±0.42*#△　0.33±0.02*#△

研究［5］显示肿瘤组织内出现细胞凋亡和增殖失衡，肿瘤组织增殖较快，细胞凋亡减少。DPC4首次发现于胰腺癌［6-7］，其编码的蛋白Smad-4是转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号传导途径的中心分子［8］，能调控细胞凋亡［9］。DPC4被认为是一种重要的肿瘤抑制基因，在胰腺、胆道、结肠、子宫等部位肿瘤发生发展过程中发挥重要作用［10-11］。但其在口腔鳞状上皮癌中的表达改变目前报道不多。在口腔鳞状上皮癌抑制基因中，标记物很多，如p53、p16、PTEN等［12］。DPC4属于Smad基因家族，所编码的Smad蛋白可将TGF-β信号传给转录启动子，从而激活转录反应。DPC4基因失活可使TGF-β信号传导通路中断，消除了TGF-β对细胞增殖的抑制，从而导致细胞恶性转化。目前，DPC4研究较多地集中于胰腺癌，在肺癌、白血病等亦有表达改变。

为探讨DPC4在牙龈癌中的表达及与牙龈癌的关系，本研究将不同分化类型的牙龈癌作为研究对象，观察DPC4在各型牙龈癌中的定性和定量表达情况。结果表明，DPC4蛋白在牙龈组织中的阳性细胞百分比明显高于各种不同分化类型的牙龈癌组织，定量结果也表明DPC4在牙龈癌组织中表达降低。随着分化程度降低，DPC4的表达率也随之降低。分化程度越低，DPC4阳性细胞百分比越低，提示DPC4突变可能在牙龈癌的发生发展过程中起重要作用。本研究提示DPC4蛋白低表达可能和牙龈癌癌变有密切的关系，其机制可能是由于DPC4基因缺失或者突变失去了对TGF-β的调控作用，导致细胞凋亡程序紊乱进而发生肿瘤。

综上所述，在临床诊疗过程中，可以通过免疫组织化学法对牙龈组织中DPC4的表达进行检测，其结果可作为诊断牙龈癌的一项指标。

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Expression of deleted in pancreatic cancer 4 in gingival cancer

Zhang Qiang1，Liu Jigang2，Yang Guohai3，et al
（1Dept of Dentist，Affiliated Hospital of North China University of Sciences and Technology，Tangshan 063000；2Dept of Dentist，Zunhua People’s Hospital，Zunhua 064200；3Dept of Dentist，Branch of Tangshan Worker Hospital，Tangshan 063000）

To observe the expression of DPC4 in gingival cancer tissue，the expression of protein andmRNA in 33 cases of gingival cancer and 8 cases of normal gum tissuewere investigated by immunohistochemistry and Real-time PCR.Results showed that the positive cell rate of DPC4 in gingival cancer was lower than that in normal gum tissue.The expression of DPC4 and the expression ofmRNA protein showed significant differences in well-differentiated，moderately differentiated，poorly differentiated gingival cancer and normal gum tissue（P＜0.05）.The expression of DPC4 in normal gum tissue is significantly higher than that in various differentiation types of gingival cancer tissue.

DPC4；gingival cancer；immunohistochemistry；Real-time PCR

R 780.2

A

1000-1492（2016）04-0598-03

2016-01-18接收

河北省2015年度医学科学研究重点课题计划项目（编号：20150087）

华北理工大学附属医院1口腔科、5神经内科，唐山063000
2遵化市人民医院口腔科，遵化 0642003唐山工人医院分院口腔科，唐山 0630004华北理工大学基础医学院，唐山 063000

张 强，男，硕士，副主任医师；
刘 昊，女，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：liuhao938@163.com