磷脂酰胆碱及胆汁酸盐体外溶脂的实验研究*

西安市中心医院烧伤整形外科 (西安710003)　郝　剑　刘　宾　李　菲　韩　悦　陶　谏



磷脂酰胆碱及胆汁酸盐体外溶脂的实验研究*

西安市中心医院烧伤整形外科 (西安710003)郝剑刘宾▲李菲△韩悦陶谏

摘要目的: 通过对保脂妥(Lipostabil)、磷脂酰胆碱(PC)以及脱氧胆酸盐(DC)的体外对照观察试验，对其溶脂效果进行初步观察及探讨。方法:分别将Lipostabil组、5%PC组、不同浓度DC组分别与分化成熟的脂肪细胞共培养，观察脂肪细胞的形态、细胞活性以及脂溶度。结果： PC由于必须溶解于溶剂中，故其独立于DC以及其它溶剂对脂肪组织的破解作用在本实验中无法得到证实；DC对于脂肪细胞具有明显的破坏作用且与其一定范围的浓度无明显正相关性；Lipostabil具明显的脂肪细胞破坏作用。结论：DC及Lipostabil组均具有明确的脂肪细胞破坏作用。

主题词磷脂酰胆碱类胆酸盐(酯)类@注射溶脂

本实验通过对目前最常用的注射溶脂药物Lipostabil以及其有效成分磷脂酰胆碱和及脱氧胆酸盐的体外对照观察试验，对其溶脂效果作用进行初步的观察及探讨。

材料与方法

1材料3T3-Ll前体脂肪细胞(ATCC细胞株来源于美国标准菌库由中国科学院上海生命科学院细胞资源中心提供。) Lipostabil[主要成分5%磷脂酰胆碱(PC)、4.75%脱氧胆酸盐(DC)，法国 Aventis 公司产]；5%PC及4.5%DC、胶原酶、胰蛋白酶、胎牛血清及DMEM/F12 培养基(美国 Sigma 公司)；噻唑兰(美国 Amresco 公司)；1-甲基 3-异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素及油红O等(北京知麟堂生物科技发展有限公司)。TDL-40C 台式离心机(上海安亭科学仪器厂), 全自动生化分析仪 7180(日本日立公司),全自动酶联免疫分析仪(瑞士 HAMILTON公司)。

2方法

2.1体外培养3T3-Ll前体脂肪细胞：用含100U/ml青、链霉素及10%胎牛血清的DMEM培养基于37℃，5%CO2培养箱中培养；当细胞融合至约70%时，传代至六孔板中；待细胞生长至完全融合后48h，加入0.5mmol/L 1-甲基3-异丁基黄嘌呤(IBMX)、1μ mol/L 地塞米松(DEX)、10 μg/ml 胰岛素(INS)； 48h后撤去IBMX和DEX；培养至第8～9天时观察分化成熟的前体脂肪细胞。

2.2分化成熟的3T3-Ll前体脂肪细胞油红O染色：光镜下观察细胞内脂滴的聚集并拍照。

2.3分组培养：于12孔培养板中培养分化成熟的脂肪细胞，培养密度5000 cells/cm2，分6组进行培养，分别为空白对照组、Lipostabil组、5%磷脂酰胆碱组、4.5%脱氧胆酸盐组。

2.4不同浓度(1%、2%、3%、4%、5%、6%、)脱氧胆酸盐与分化成熟的脂肪细胞共培养。

3观察项目

3.1光镜下观察细胞形态及状态。

3.2MTT法鉴定细胞活性:收集各组细胞于96孔板中，每孔加MTT溶液20μl；继续孵育4 h，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150μl DMSO，脱色摇床振荡10min，选择490nm(570nm)波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

3.3用 5% PC、4. 5% DC、Lipostabil 分别作用于分化的脂肪细胞 72 h，采用酶法检测培养液内中的 TC 含量，评价其脂肪细胞的溶解程度。

结果

1光镜下脂肪细胞形态及状态3T3-Ll前体脂肪细胞(图1)；分化成熟的3T3-Ll脂肪细胞(图2)； 油红染色的3T3-Ll脂肪细胞(图3)； 成熟的脂肪细胞与各实验组药物共培养后均出现明显的溶解与破坏(图4)。

图1　3T3-Ll前体脂肪细胞(10×10)

图2　分化成熟的3T3-Ll脂肪细胞(10×10)

2MTT法鉴定细胞活性

2.1选择第2天培养的快速增殖脂肪细胞开始给药，各组细胞分别于接种后0～4d采用MTT法测细胞A值。与对照组比较，三组细胞的增殖活性显著降低(P<0.05)，其中DC组作用更明显，但三组间差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

图3　油红染色的3T3-Ll脂肪细胞(10×10)

图4　溶解破坏的3T3-Ll脂肪细胞(10×10)

2.2不同浓度的DC对脂肪细胞活性的影响：选择第2天培养的快速增殖脂肪细胞分别给于给予1%-6%浓度的DC，各组细胞分别于接种后0～4d采用MTT法测细胞A值。与对照组(DMEM)比较，各浓度组细胞的增殖活性均显著降低(P<0.05)，浓度越高作用相对更明显，但各浓度组间差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

3脂解程度测定测定培养基中甘油含量作为评价脂肪分解的指标。脂肪分解数据表示为每升脂肪细胞压积的毫摩尔甘油释放量(mmol/L packed cell volume, mmol/LPCV)。PC 组 TC(4.09±0.78mmol/L)、DC(4.28±0.81mmol/L)、Lipostabil(4.19±0.79mmol/L)显著高于对照组 TC(P<0.05)；结果显示DC组溶脂作用较好，但三组间比较无统计学差异(P>0.05)。

表1　不同溶脂成份对脂肪细胞增殖活性不同时间作用效果

注：与对照组(DMEM)比较，*P<0.05；各实验组间比较，P>0.05

表2　不同浓度DC对脂肪细胞增殖活性不同时间作用效果±s)

注：与对照组(DMEM)比较，*P<0.05；各实验组间比较，P>0.05

讨论

目前的身体塑形技术包括两个发展方向：一方面，腹壁整形和吸脂等传统手术仍将是最有效和流行的美容手术；另一方面，以消减局部皮下脂肪为目的的新型能源类和注射类技术正在迅速得到开展和部分认同。

Lipostabil由法国Sanofi-Aventis公司生产，在部分欧洲国家被许可用于静脉注射治疗脂肪栓塞、血脂障碍和酒精性肝硬化。其为含大豆提取卵磷脂(Phosphatidylcholine，PC)5%、去氧胆酸(Deoxycholate，DC)4.5%及维生素E、氢氧化钠、乙醇和苯甲醇的无菌水溶剂。Lipostabil注射消脂的疗法受到国际业界关注始于巴西皮肤科医生Patricia Rittes发表的一篇关于眶下注射Lipostabil消脂的报告[1]。之后，关于局部注射磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine,PC)及脱氧胆酸盐(Deoxycholate,DC)消脂的研究报告大量涌现[2-7]。而随着大量的相关双盲临床试验而获得了一些重要的发现[8]，在认同注射溶脂的脂肪溶解作用的同时，对其临床安全性也提出了质疑。为此我们通过对目前最常用的注射溶脂药物的有效成分，磷脂酰胆碱以及脱氧胆酸盐的体外对照观察试验，对其溶脂效果作用进行初步的观察及探讨。

从体外实验结果来看，5%PC组与Lipostabil一样同样具有明显的脂肪细胞破坏作用。但是由于PC不可溶解于水，而实验中PC的溶剂DC或者其他胆汁盐以及乙醇等也会产生类似的脂肪溶解作用。因此PC独立于DC以及其它溶剂对脂肪组织的破解作用在本实验中无法得到证实，目前国内的相关试验和临床研究报道也很少。至于PC在Lipostabil中的真正作用，有研究推测： PC可能具有对DC溶解脂肪组织进行乳化和消除的作用，可以减轻注射溶脂后常见副反应，但具体机制不清楚。这一点我们将在后期的动物实验进一步进行验证。

DC是在肝脏分泌初级胆汁酸(胆酸)后由肠道细菌生成的次级胆汁酸，存储于胆囊内，分泌进入十二指肠，其中包含可溶解摄入油脂的游离结合胆汁酸。之后，大部分(90%～95%)DC被再次吸收，但被排出DC由从肝脏胆固醇合成物取代。因为胆酸是胆固醇的最终产品，因此不再降解为其他降解物。 DC被用于试验清洁剂已有数十年历史，是药厂普用于生产静脉注射制剂的常规生理兼容溶剂成分之一。动物和人体组织与DC或PC/DC复合物接触后可发生内出血、炎症和组织坏死。作为一种非离子清洁剂，DC还可引发细胞膜穿孔、细胞质渗漏、胞膜不稳，从而导致溶解。本实验中DC组对于脂肪细胞的溶解作用更加明显、持久，且其对脂肪细胞的破坏作用与实验组中的浓度相关性不大。因此DC在Lipostabil中不仅充当着PC溶剂的角色，其对脂肪细胞的溶解和破坏也起着非常重要的作用，另外我们也将在后续实验中验证是否可以在溶脂药物的配方中适当降低DC的浓度以减少其对机体的不良反应。

Lipostabil组在体外试验中，与其它两组一样均对脂肪细胞有着明显的脂肪细胞破坏作用。那么PC或DC溶解脂肪细胞与Lipostabil的区别在于哪里？ 有研究推测： PC和DC复合溶液可导致混合胶束聚合物形成，从而(因游离DC减少)减弱DC的溶脂活性。另外 PC可能具有对DC溶解脂肪组织进行乳化和消除的作用；可能有减轻注射溶脂后常见副反应的作用，但其具体机制仍待进一步研究。

目前，由于注射溶脂药物剂量和配方的非标准化引发了许多并发症。其中最常见者包括：即时水肿、红斑、瘙痒、甚至坏死和炎症组织结节等。在这些注射部位出现的副反应，多数可能与注射技术或注射药物浓度过高有关。对于注射溶脂药物中PC、DC各自的比例、浓度以及注射时的层次把握，我们将在接下来的动物实验进行进一步探讨和验证。

总之，DC及Lipostabil均具有明确的脂肪细胞破坏作用，且DC的脂肪细胞破坏作用在一定范围内与其浓度无明显正相关性。

参考文献

[1]Rittes PG. The use of phosphatidylcholine for correction of lower lid bulging due to prominent fat pads[J]. Dermatol Surg, 2001,27:391-2.

[2]Rotunda AM, Kolodney MS. Mesotherapy and phosphatidylcholine injections clarification and review[J]. Dermatol Surg, 2006,32:465-480.

[3]Ablon G, Rotunda AM. Treatment of lower eyelid fat pads using phosphatidylcholine: Clinical trial and review[J]. Dermatol Surg, 2004,30:422-427.

[4]Rittes PG. The use of phosphatidylcholine for correction of localized fat deposits[J]. Aesthetic Plast Surg, 2003,27:315-318.

[5]Treacy PJ, Goldberg DJ. Use of phosphatidylcholine for the correction of lower lid bulging due to prominent fat pads[J]. Cosmet Laser Ther, 2006,8:129-132.

[6]Bechara FG, Mannherz HG. Induction of fat cell necrosis in human fat tissue after treatment with phosphatidylcholine and deoxycholate[J].Eur Acad Dermatol Venereol, 2012 ,26(2):180-5.

[7]Duncan D, Rotunda AM.Injectable therapies for localized fat loss: State of the art.Clin Plast Surg, 2011, 38(3):489-501.

(收稿：2016-03-07)

【中图分类号】R33

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.08.003

Experimental study of phospholipids and deoxycholate in vitro lipolysis

Department of Bum and plastic surgery, Xi’an Central Hospital(Xi'an 710003)

Hao JianLiu BinLi Feiet al

ABSTRACTObjective By fat injection lipolysis medication properly (Lipostabil), phosphatidylcholine (PC) and deoxycholate (DC) in vitro controlled observation experiment, observing and discussing its preliminary lipolysis effect. Methods: The Lipostabil group, 5% PC group, various concentration DC group were co-cultured with fat cells ， cell morphology、 activity and lipid solubility was observed. Results: PC-independent DC and other solvents cracks on the role of adipose tissue in this experiment could not be confirmed; DC for adipocytes has obvious destructive effects. Conclusion: DC and Lipostabil has a clear role in the destruction of fat cells.

KEY WORDSPhosphatidylcholinesCholates@Injectionsolution

*陕西省科技攻关项目(SFα-06)

△西安医学院护理学院

▲通迅作者