不同时间慢性间歇性缺氧对大鼠海马细胞凋亡及Caspase- 3表达的影响

西电集团医院神经内科(西安710077)　张　恒　姚　力　侯沛红　何剑波　李会琪



不同时间慢性间歇性缺氧对大鼠海马细胞凋亡及Caspase- 3表达的影响

西电集团医院神经内科(西安710077)张恒姚力△侯沛红何剑波李会琪

摘要目的：研究在不同持续时间下慢性间断性缺氧(CIH)对大鼠海马区中神经细胞凋亡及Caspase-3表达的影响。方法：取健康雄性SD大鼠30只随机分为三组，即对照组(10只)、CIH4周组(10只)和CIH8周组(10只)。分别用原位未端标记法(TUNEL)和免疫组织化学方法检测大鼠脑组织中的凋亡细胞和Caspase-3蛋白表达。结果：CIH8周组同其他两组相比，具有显著差异(P<0.01)；组间多重比较也存在着显著差异(P<0.05)。CIH4周组及CIH8周组海马区均可见Caspase-3阳性细胞表达增强(P<0.01)，CIH8周组Caspase-3阳性表达与CIH4周组比较有统计学意义(P<0.05)。结论:伴随着CIH持续时间的不断增加，神经细胞凋亡的数量也不断增加，Caspase-3蛋白表达也增强(P<0.01)。CIH持续时间对大鼠脑组织细胞凋亡有着重要意义。

主题词缺氧 细胞凋亡@Caspase- 3

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(简称OSAS)主要表现为不断重复出现的低氧、高碳酸血症以及睡眠混乱，并最终导致器官出现损伤[1-2]。Caspase-3是半胱氨酸蛋白酶的级联通路的效应分子，主要功能就是控制细胞凋亡的发生与否。有文献报道慢性间歇性缺氧(CIH)不同严重程度对大鼠皮层神经细胞凋亡有着差异性表达[3]，但对CIH不同持续时间报道却凤毛麟角。本文根据OSAS患者发生CIH时的主要特征来建立大鼠模型 ,采取不同时间长度干预，观察 CIH 对大鼠前额叶区神经细胞凋亡及Caspase- 3表达的影响。

材料与方法

1材料30只雄性200～250gSD大鼠，设对照组、CIH4周组、CIH8周组(n=10),Caspase-3兔抗鼠多克隆抗体、MaxVisionTM一步法试剂盒、原位细胞凋亡检测(TUNEL)试剂盒。

2方法本文所选用的模型参照了文献[4]的方法，制作出相应的氧浓度变化趋势图，如图1。实验结束后进行TUNEL染色及免疫组织进行化学染色。在光镜下观察，使用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件来测量相应的累积吸光度值(简称为IOD) 表示Caspase- 3表达水平。

图1　间歇性缺氧箱内氧浓度变化趋势图(1个周期)

结果

在400倍镜下观察发现凋亡的细胞呈蓝黑色，结果可以参照凋亡小体。对照组则无TUNEL阳性细胞；与其余两组比较，CIH8周组凋亡细胞明显增多(F=29.32，P<0.01)；实验组海马区均可见Caspase-3阳性细胞表达增强，与对照组比较有显著性差异(P<0.01)。各组间多重比较有显著性差异(P<0.05)，见表1。

表1　各组大鼠脑组织TUNEL阳性细胞数比较及Caspase-3免疫组化结果比较

注：与对照组比较，*P<0.01；与CIH4周组比较，△P<0.05

讨论

OSAS的后果已被广泛研究从实验和临床水平证实，主要病理就是CIH，是脑血管疾病的独立危险因素。全身和器官特异性氧化应激通过间歇性缺氧触发被认为OSAS这些中期和长期后果的关键作用[5-6]。细胞凋亡尤其在神系统变性病的发病机制中起到至关重要的作用，针对CIH以后的大脑神经细胞凋亡现象以及相应的机理进行研究，能够很好地揭示这些疾病之间的关系。本研究通过控制密闭箱内不同气体持续时间，设置了静息状态，并通过快速氧气输入，使箱内氧浓度快速提升到大气中氧浓度水平。这种以浓度结合时间切换方式，更加地接近OSAS的临床真实状态。经缺氧处理后，经过测量氧浓度和大鼠动脉血气的分析以后，可以得出结论：这种处理方法能够很好地模拟出OSAS的血氧变化情况。

所谓的细胞凋亡，其实就是受到细胞内的基因和酶控制的一个过程，涉及到很多个通路，而对这些通路起关键作用的就是Caspase 家族。其中Caspase-3 是最重要的一个起执行作用的蛋白。TUNEL法染色法可以对单个凋亡细胞进行原位染色，是检测细胞凋亡的特异性和敏感性很高的方法。本研究结果发现，CIH模型中大鼠的海马神经细胞中的Caspase-3蛋白表达会随着CIH时间的长短而变化，两者呈正相关关系，而且相应的过程能够同神经细胞凋亡的过程大致相同，这也就是说随着Caspase-3蛋白的表达增多，能够在很大程度上激活了Caspase家族的蛋白酶级联反应，这才导致神经细胞开始出现过度凋亡的现象，这同时也说明了Caspase-3其实是参与了CIH大鼠的神经细胞凋亡的调控过程，这与国内多数研究结果相一致。也提示我们不同的CIH持续时间对神经元细胞凋亡有着一定程度的影响。

参考文献

[1]Hui X, Wing-ho Y. Chronic intermittent hypoxia-induced deficits in synaptic plasticity and neurocognitive functions: a role for brain-derived neurotrophic factor[J]. Acta Pharmacologica Sinica,2012,33(1):5-10.

[2]谢柏梅，王博，董玉.慢性阻塞性肺疾病患者的认知损害研究进展[J]. 陕西医学杂志，2015，44(1)：119.

[3]赵雅宁，王红阳，李琳,等. 不同程度间歇性低氧对大鼠不同脑区Bax、Bcl-2表达的影响[J]. 中国老年学杂志，2015，35(1)：162-163.

[4]宋爱玲，曾奕明.慢性间断性缺氧对小鼠肾组织结构、基质金属蛋白酶及其组织抑制因子表达的影响[J]. 国际呼吸杂志，2007, 27(11):808-812.

[5]吴雨岭，余鸿，徐富翠.缺氧对鼠胚大脑神经元c-Fos表达的影响及当归保护作用[J]. 陕西医学杂志，2006，35(4)：391-393.

[6]Farias JG, Puebla M, Acevedo A,etal. Oxidative stress in rat testis and epididymis under intermittent hypobaric hypoxia: protective role of ascorbate supplementation[J]. Androl，2010，31:314-321.

(收稿：2016-01-04)

通讯作者△

【中图分类号】R33

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.08.002