tst和pvl基因阳性金黄色葡萄球菌流行情况及分子特征

赵焕强， 邹玉涵， 金　姝， 舒　文， 汤　荣， 刘庆中



tst和pvl基因阳性金黄色葡萄球菌流行情况及分子特征

赵焕强1， 邹玉涵2， 金姝2， 舒文1， 汤荣1， 刘庆中1

摘要：目的 了解中毒性休克综合征毒素-1的tst基因和杀白细胞素的pvl基因阳性金黄色葡萄球菌（金葡菌）流行情况及其附属基因调节子（agr）和葡萄球菌盒式染色体（SCCmec）型别。方法 收集上海市及浙江省共7所医院的916株金葡菌，聚合酶链反应（PCR）检测tst、pvl、mecA和mecC基因，并对tst或pvl基因阳性菌株作agr及SCCmec （针对甲氧西林耐药金葡菌，MRSA）遗传学分型。结果 916株金葡菌中tst阳性208株，阳性率22.7 %；pvl阳性35株，阳性率3.8 %；mecA阳性665株（MRSA），未检测到mecC基因。在665株MRSA中，tst阳性198株（29.8 %），agr和SCCmec分型均以2/Ⅱ型为主，分别占97.0 %和94.4 %；pvl阳性14株（2.1 %），agr分型以1型（85.7 %）为主，SCCmec分型以Ⅲ型（42.9 %）和Ⅳa型（28.6 %）为主。在251株甲氧西林敏感金葡菌（MSSA）中，tst阳性10株（4.0 %）；pvl阳性21株（8.4 %）。tst阳性率在MRSA菌株中较MSSA中高，而pvl检出率则在MSSA菌株中较高，且浙江地区MRSA中 pvl的阳性率高于上海菌株，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 tst基因在MRSA菌株中阳性率较MSSA高；pvl阳性率相对较低，但因其与某些严重的金葡菌感染相关，临床应予以关注。

关键词：金黄色葡萄球菌； tst基因； pvl基因； SCCmec分型； agr分型

金黄色葡萄球菌（金葡菌）是引起医院和社区感染的常见病原菌。尤其是甲氧西林耐药金葡菌（MRSA），其耐药谱广，致病性强，并可引起医院感染的暴发流行，严重威胁人类健康。金葡菌引起的各种临床感染与该菌表达的多种毒力因子密切相关，携带中毒性休克综合征毒素-1（toxic shock syndrome toxin-1， TSST-1）或（和）杀白细胞素（panton-valentine leukocidin， PVL）基因的菌株毒力更强，与患者感染后疾病的严重程度密切相关［1］。

本研究对上海市及浙江省共7所综合性医院分离的916株金葡菌进行pvl和tst基因检测，以了解这2种基因在临床分离的金葡菌中分布状况，同时对2种基因阳性菌株作agr和SCCmec分型，为丰富临床感染菌株的分子流行病学资料提供数据。

1　材料与方法

1.1菌株

收集上海市和浙江省7所医院分离自尿液痰液、分泌物、血液、脓液、引流液和咽拭子等标本的916株非重复金葡菌：2013年1月—2014 年12月上海交通大学附属第一人民医院113株2010年2月—2014年3月上海市普陀区人民医院514株、2013年1月—2014年12月上海交通大学附属第六人民医院82株、2014年8—10月上海交通大学医学院附属同仁医院23株、2013年2月—2014年12月上海交通大学医学院附属瑞金医院71株、2014年1—12月浙江萧山医院30株、2014年1—10月浙江丽水市中心医院83株。所有金葡菌的分离及鉴定严格按照临床检验操作规程进行。

1.2仪器与试剂

VITEK-2系列全自动微生物鉴定仪为法国生物梅里埃公司产品；琼脂糖凝胶电泳仪及图像处理系统为上海天能科技有限公司产品；PCR缓冲液、三磷酸脱氧核糖核苷（dNTPs）和Taq酶为MBI公司产品；蛋白酶K为Merch公司产品；溶葡酶购自上海生工生物工程有限公司；聚合酶链反应（PCR）引物的合成及扩增产物测序由上海生工生物工程有限公司完成。PCR所用扩增tst、pvl、mecA、mecC基因，SCCmec及agr分型的引物序列［2-7］，见表1。

表1　PCR扩增所用引物Table 1 Primers used in PCR amplifcation

1.3DNA模板的制备

将金葡菌转种于血平皿，35 ℃孵育16～18 h。挑取2～3个菌落，混悬于100 μL pH 8.0的TE缓冲液中，加溶葡酶 （1 mg/mL） 5 μL，37 ℃水浴35 min，100 ℃金属浴20 min，12 000×g离心5 min，取上清液-70 ℃保存备用。

1.4mecA、mecC、tst 和pvl 基基因检测

PCR扩增mecA、mecC、tst及pvl基因，扩增体系25 μL，反应条件：94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 s，53 ℃ （mecA和mecC） 或55 ℃（pvl和tst） 退火30 s，72 ℃延伸1 min，进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min。2%琼脂糖凝胶电泳 （5 V/cm） 20 min，凝胶成像系统分析PCR产物。随机挑选每个基因的一PCR产物测序，经BLAST程序比对分析证实扩增产物基因的正确性。1.5分型

对tst或（和）pvl基因阳性菌株进行agr分型，PCR扩增反应体系20 μL，反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸5 min。对tst或（和）pvl基因阳性MRSA菌株参照文献，多重PCR进行SCCmec分型［6］。

1.6统计学分析

agr 和SCCmec采用SAS 9.3软件进行统计学处理，行卡方检验和确切概率法检验，比较率的差别，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1MRSA菌株确定

916株金葡菌中665株检出mecA基因，被确认为MRSA；其余251株未检出mecA及mecC基因，为MSSA。

2.2tst 和pvl 基因在金葡菌中的分布

tst 和pvl 基因在金葡菌中的分布情况，见表 2 和图1。tst 阳性菌株数大于pvl 阳性菌株数；tst基因多检出于MRSA，与MSSA 中的检出率差异有统计学意义（ 29.8 ％ 对 4.0 ％，P＜0.05），而pvl基因在MSSA 中的检出率明显高于MRSA（ 8.4 ％对 2.1 ％，P＜0.05）。tst 基因阳性菌株主要分布于重症监护病房（ICU）、烧伤科、骨科、呼吸内科及肿瘤科；pvl阳性菌株主要分布于ICU、皮肤科、 烧伤科及骨科。发现2株MRSA同时携带tst和pvl基因，分别来自ICU患者的痰液和骨科患者的创面分泌物。

表2　tst和pvl基因在金葡菌中的检出情况Table 2 Detection of tst and pvl genes in S.aureus

图1　tst、pvl及mecA基因PCR扩增电泳结果Figure 1 Electrophoretic analysis of the PCR products of tst，pvl and mecA genes in S. aureus

沪浙两地MRSA的 tst阳性率差异无统计学意义 （29.9 % 对 27.8 %，P＞0.05），pvl阳性率有显著差异 （1.1 % 对 19.4 %，P＜0.05）；两地MSSA的 tst及pvl阳性率差异均无统计学意义（P＞0.05）。各医院之间tst及pvl阳性率差别较大，其中上海市普陀区人民医院MRSA tst基因阳性率最高（37.4 %），上海地区其他4所医院MRSA tst总阳性率为7.1 %（11/156）。分型

2.3agr 及SCCmec

198株tst阳性的MRSA中，192株为agr 2型（97.0 %），3株为agr 1型，3株未能分型，未发现agr 3及 4型；SCCmec分型以SCCmec Ⅱ型为主，占94.4 % （ 187/198），另有3株为SCCmecⅢ型，1株为SCCmec Ⅳa型，7株未能分型。10株tst阳性MSSA中，agr 1和2型各5株。

14株pvl阳性MRSA 中，agr分型以agr 1型为主 （85.7 %，12/14），另各有1株为agr 2和3型；SCCmec分型以Ⅲ型和Ⅳa型为主，分别占42.9 % （6/14）和28.6 % （4/14），另有1株Ⅱ型，3株未能分型。21株pvl阳性MSSA的 agr分型则以agr 1和3型为主，分别占66.7 % （14/21）和23.8 % （5/21），另有2株为agr 4型。部分菌株SCCmec分型，见图2。

图2　SCCmec分型电泳结果Figure 2 Results of gel electrophoresis for SCCmec typing

3　讨论

金葡菌尤其是MRSA危害人类健康的关键在于它日益增强的耐药性及具有分泌各种毒素的潜能［8］。TSST-1是金葡菌产生的一种毒素蛋白 （相对分子质量219 000），由位于致病岛2 （SaPI2）上的tst基因编码，是中毒性休克综合征的主要致病因子［8］，中毒性休克综合征起病急骤、进展迅速，常伴有多器官功能损害，具有较高病死率，因而受到世界各国学者的关注。PVL是一种钻孔毒素，其两种组分LukS-PV和LukF-PV能协同破坏宿主多形核细胞、单核细胞、巨噬细胞等细胞膜，促使靶细胞释放多种炎性介质，引发血管扩张、炎性细胞浸润、组织坏死等一系列炎性反应，最终使细胞坏死或凋亡。有研究表明，相对于pvl阴性金葡菌，pvl阳性菌株引起的侵袭性感染患者的住院时间更长［9］，且感染pvl阳性菌株的患者趋于年轻化［10］。

据世界不同国家和地区的报道，tst阳性菌株在临床分离的MRSA中占10 %～90 %：日本［11］、伊朗［12］、荷兰［13］等报道，临床分离率分别为75 %、11.6 %、17 %；国内王凤玲等［1］报道为12.2 %，张传领等［14］对460株金葡菌行tst检测，总检出率22.8 %，其中在MRSA中检出率为29.4 %，MSSA中为18.6 %。以上数据表明，金葡菌tst基因的携带情况可能与地域差异有关。本研究结果显示，tst的总检出率（22.7 %）及在MRSA中的检出率（29.8 %）与张传领等［14］的报道基本一致，且MRSA的tst基因检出率高于MSSA （29.8 % 对 4.0 %），差异有统计学意义（P＜0.05）；沪浙两地MRSA tst基因阳性率无显著差异 （29.9 % 对 27.8 %，P＞0.05）。从医院分布来看，上海某医院MRSA tst基因阳性率最高（37.4 %），可能与该院分离菌株的标本类型 （主要为痰液）及科室来源分布（有较大部分菌株分布在介入科、肿瘤科、呼吸内科、中医科等老年人较多的科室）较单一导致流行克隆株较单一有关。若去除该医院的473 株MRSA，分析上海地区MRSA tst基因阳性率，则降低为7.1 %，可能此数据更具有代表性。

同样，pvl基因的阳性率也存在地域差异：国外有报道MSSA 中pvl阳性率为30 %［10］，MRSA中为20 %［15］；CUPANE等［9］对拉脱维亚一所儿童医院分离的金葡菌研究发现，pvl基因阳性率甚至达75 %，其中MSSA占60.7 %。近年国内有关报道MRSA中 pvl阳性率在0～40%［1，16-19］；关于MSSA中pvl阳性率的报道较少，王凤玲等［1］报道为2l.2 % ，邹自英等［17］为11.4 %。本研究结果显示，分离自沪浙7所医院的临床MRSA中pvl阳性率为2.1 %，MSSA中为8.4 %，均处于较低水平，且检出率差异有统计学意义（2.1 % 对 8.4 %，P＜0.05）；沪浙两地MRSA pvl基因阳性率明显不同，差异有统计学意义 （1.1 %对 19.4 %，P＜0.05）。浙江地区两所医院MRSA pvl总阳性率 （19.4 %）与张传领等［20］报道的浙江地区MRSA pvl分布情况（20.8 %）基本一致。在35株pvl阳性菌株中60 %为MSSA，由于MSSA的耐药谱相对较窄，所引起的感染往往被临床忽视，而产PVL菌株的致病力强，可能会给患者造成不良后果。

有报道称，tst 阳性 MRSA可能与agr 3型有关［21］， SCCmec分型以 Ⅱ和Ⅲ型居多［14］。而本研究tst阳性MRSA以agr2/SCCmecⅡ型为主，分别占97.0 %和94.4 %；tst阳性MSSA中agr 2型也占了较大比例（50 %）。国外有文献报道，社区获得性MRSA易携带pvl基因，SCCmec分型常为Ⅳ型或Ⅴ型［22］，而国内张传领等［20］检出的104株pvl阳性菌株以 SCCmecⅢ型和Ⅱ型为主；姚丹等［23］报道的8株pvl阳性社区获得性MRSA 中，6株为SCCmec Ⅲ型 （75 %），2株为SCCmecⅡ型 （25 %）。本研究结果与上述报道有所不同：pvl阳性MRSA 以SCCmec Ⅲ型和Ⅳa型为主，分别占42.9 %和28.6 %。此外，14株pvl阳性MRSA中，85.7% 为agr 1型；21株pvl阳性MSSA以agr 1和3型为主，分别占66.7 %和23.8 %。ZHAO等［24］报道显示，pvl阳性金葡菌的agr分型较分散，未发现与某种agr型别有特定联系。本研究中pvl阳性菌株与agr 1或3型是否关联还有待更大量的菌株数据证实。本研究同时发现2株MRSA同时携带tst和pvl基因，1株为agr 2/SCCmec Ⅱ型，另1株为agr 1/SCCmecⅣa型。有报道称携带基因pvl 和tst的MRSA除对万古霉素敏感外，对其他抗菌剂均耐药［1］，应引起临床注意。

致谢：感谢上海交通大学附属第六人民医院汤瑾、上海交通大学医学院附属同仁医院张正银、上海交通大学医学院附属瑞金医院韩立中、浙江省丽水市中心医院任建敏、浙江萧山医院张传领提供菌株。

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2. 上海市普陀区人民医院。

中图分类号：R378.11

文献标识码：A

文章编号：1009-7708（2016）03-0353-06

DOI：10.16718/j.1009-7708.2016.03.018

收稿日期：2015-06-16 修回日期：2015-08-17

基金项目：上海市自然科学基金（12ZR1425000）；国家自然科学基金（81371872）。

作者单位：1. 上海交通大学附属第一人民医院检验科，上海201620；

作者简介：赵焕强（1990—），男，硕士研究生，主要从事病原菌致病机制和耐药机制研究。

通信作者：刘庆中，E-mail：jiaodamedicine@foxmail.com。

Prevalence and molecular profle of the Staphylococcus aureus strains harboring tst and/or pvl genes

ZHAO Huanqiang， ZOU Yuhan， JIN Shu， SHU Wen， TANG Rong， LIU Qingzhong. （Department of Laboratory Medicine， Shanghai First People's Hospital， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 201620， China）

Abstract:Objective To investigate the prevalence， accessory gene regulator （agr） and staphylococcal cassette chromosome mec （SCCmec， only for methicillin resistant S. aureus， MRSA） types of the S. aureus strains carrying toxic shock syndrome toxin-1 （tst） and/or panton-valentine leukocidin （pvl） genes. Methods Nine hundred and sixteen isolates of S. aureus were collected from seven hospitals in Shanghai and Zhejiang Province and subjected to detection of tst， pvl， mecA and mecC genes by polymerase chain reaction （PCR）. The agr and SCCmec （only for MRSA） types were determined in the tst or pvl gene positive isolates. Results Of the 916 isolates， 208 carried tst gene （22.7%）， 35 harbored pvl gene （3.8%）， and 665 were mecA positive （MRSA）. No isolate was mecC positive. Out of the 665 MRSA isolates， 198 hosted the tst gene （29.8%）. The most common agr and SCCmec types were agr 2 （97.0%） and SCCmec II （94.4%）， respectively. For the pvl gene， only 14 isolates were positive （2.1%）. The agr 1 （85.7%），SCCmec III （42.9%） and SCCmec IVa （28.6%） were the most common agr type and SCCmec type. In the 251 methicillin-sensitive S. aureus （MSSA） isolates， 10 carried tst gene （4.0%） and 21 carried pvl gene （8.4%）. The prevalence of tst gene in MRSA was higher than that in MSSA， while the prevalence of pvl gene was just the opposite. However， the prevalence of pvl gene in MRSA isolates from Zhejiang Province was higher than that in the MRSA isolates from Shanghai （P＜0.05）. Conclusions The prevalence of tst gene in MRSA is signifcantly higher than that in MSSA. The prevalence of pvl gene is low in the S. aureus isolates studied. However， clinicians should pay close attention to these strains due to the implication of PVL toxin in somesevere S. aureus infections.

Key words:Staphylococcus aureus； tst gene； pvl gene； SCCmec typing； agr typing