虎源金黄色葡萄球菌耐药性的检测及耐β—内酰胺类药机制的研究

万蝶　吴长德

摘 要：金黄色葡萄球菌在自然界中的分布极其广泛，存在于空气、水和土壤中，寄居在人和动物的皮肤黏膜、鼻腔、咽喉以及胃肠道等处，是临床上常见的致病菌之一。由于其可以产生溶血毒素、肠毒素、血浆凝固酶、耐热核酸酶等，在临床可引起各种家畜的呼吸道感染、子宫内膜炎、外伤化脓、乳房炎，若治疗不及时会引起败血症而导致死亡。近些年，随着抗生素的广泛应用，目前临床分离的金黄色葡萄球菌耐药现象非常严重，而且出现多重耐药现象，这给临床治疗带来极大的困难，金黄色葡萄球菌的耐药问题已经引起人们的极大关注。

东北虎作为世界一级保护动物，近年来时有病原微生物感染死亡的报道。本研究旨在研究虎源金黄色葡萄球菌对常用抗菌药物的耐药性，并通过对相关耐药基因的检测，分析其耐药机制，为今后指导临床合理使用抗生素防控野生动物金黄色葡萄球菌感染提供理论依据。

关键词：虎；金黄色葡萄球菌；耐药性；耐药机制

本实验采集病死东北虎的化脓性肾脏，通过细菌的分离培养、纯化，染色、镜检以及PCR方法进行鉴定；以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因（nuc）为靶基因，选择特异性引物进行PCR扩增，用来鉴定金黄色葡萄球菌；采用纸片扩散法测定分离菌株对常用抗菌药物的敏感性，分析其耐药性；液体培养分离菌株，提取细菌DNA，根据药敏实验的结果，针对相应的耐药基因设计引物，通过PCR方法对相关耐药基因进行扩增、测序，分析其耐药机制。

1 虎源金黄色葡萄球菌的分离与鉴定

1.1 实验方法

1.1.1 金黄色葡萄球菌的分离培养 将沈阳森林野生动物园的病死东北虎肾脏及时带回实验室。切取平整病料，在琼脂平板上划板，于37℃恒温培养箱中培养24小时，将可疑菌落涂片染色镜检，并继续划板，进行纯化培养。若确定为金黄色葡萄球菌，则需挑取菌落于营养肉汤培养基中，震荡混匀后放入37℃恒温培养箱中，培养8小时后，置于30%甘油保存备用。

1.1.2 金黄色葡萄球菌的鉴定 形态鉴定和革兰氏染色镜检；并提取细菌基因组DNA，设计、合成金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因nuc引物，利用PCR鉴定金黄色葡萄球菌，并经琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物大小。

反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30S，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min结束反应，产物于4℃保存。

1.2 实验结果

1.2.1 形态鉴定结果 在普通营养琼脂上形成灰白色、湿润、隆起、表面光滑的菌落（图1）。

1.2.2 染色结果 对分离菌进行革兰氏染色，显微镜下观察，可见葡萄串状排列的革兰氏阳性球菌，无鞭毛、无荚膜、无芽孢，可初步判定为葡萄球菌（图2）。

1.2.3 耐热核酸酶基因检测结果 提取菌株基因组DNA为模板，对nuc基因进行PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳，在250bp附近出现单一清晰的目的条带，扩增产物片段大小与预期目的片段相符，为279bp（图3）。

1.2.4 nuc基因测序比对结果 将PCR产物的测序结果与NCBI上收录的基因进行比对，同源性为99%，确定扩增产物为nuc基因。

2 金黄色葡萄球菌体外药物敏感性实验

2.1 实验材料

营养肉汤培养基、营养琼脂培养基。

2.2 抗菌药物

药敏纸片；β-内酰胺类：阿莫西林、氨苄西林、头孢噻肟；氨基糖苷类：阿米卡星、庆大霉素、链霉素；大环内脂类：红霉素、克林霉素、阿奇霉素；喹诺酮类：恩诺沙星、环丙氟哌酸；四环素类：四环素、强力霉素；氯霉素类：氯霉素、氟苯尼考；糖肽类：万古霉素；共计7大类16种。

2.3 实验方法

2.3.1 将菌株活化 -80℃备用的金黄色葡萄球菌菌株在营养肉汤培养基上活化培养48小时。

2.3.2 增殖培养 从增殖菌液中取15微升放入20毫升营养肉汤后，放置在恒温培养箱中培养。

2.3.3 对菌浓度的测定 以营养肉汤为空白对照，不同生长阶段的菌液为样品，用分光光度计测定其OD值，OD600的数值范围在0.6左右时为对数生长期（约培养8小时），此时适合做药敏实验。

2.3.4 药敏实验 将菌液均匀涂布于培养基平板上，用镊子夹取药敏片贴在培养基平板上。每种药物贴3次药敏片，将培养基平板放入37℃恒温箱，16～18小时后观察结果。参照CLSI（2012）公布的三种形式：敏感（Susceptible）、中介（Intermediate）、耐药（Resistant），对抑菌圈大小的标准作出判定。个别使用药物CLSI（2012）没有列出，按杭州天和微生物试剂有限公司提供的标准进行解释。

2.4 实验结果

观察体外药物敏感性实验的抑菌环，并用游标卡尺测量抑菌环直径的大小，记录结果（图4）。

从表3可以看出，金黄色葡萄球菌分离菌株对阿米卡星、红霉素、克林霉素、阿奇霉素、恩诺沙星、环丙氟哌酸、四环素、强力霉素、氟苯尼考和庆大霉素表现出敏感的状态；对氯霉素和万古霉素表现出中介的状态；对β-内酰胺类药的阿莫西林、氨苄西林和头孢噻肟表现出耐药的状态。

3 虎源金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类药耐基因的检测

3.1 实验方法

3.1.1 引物设计 提取金黄色葡萄球菌基因组DNA，并设计合成β-内酰胺类药物耐药基因PCR扩增引物（表4）。

3.1.2 β-内酰胺类药物4种耐药基因的检测 以金黄色葡萄球菌基因组为模板，对mecA、femA、TEM、SHV等4种基因进行PCR扩增检测，反应体系为30微升（表5）。

反应条件：95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，退火30秒，扩增mecA退火温度为57℃，扩增femA的退火温度为55℃，扩增TEM的退火温度为55℃，扩增SHV的退火温度为60℃，72℃延伸1分钟，从第二步起共35个循环，最后72℃延伸10分钟结束反应，产物于4℃保存。

3.1.3 琼脂糖凝胶电泳 取5微升PCR扩增产物加入1.5%琼脂糖凝胶中，120V电泳30分钟，选用DL-2000 DNA Marker分子量标准，用凝胶成像系统拍照分析。

3.1.4 PCR产物测序 将胶回收的PCR产物直接测序，测序结果利用DNAMAN软件进行序列分析，并与GenBank上收录的序列进行比对和分析。

3.2 实验结果

3.2.1 PCR扩增结果 TEM基因PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，紫外光观察，显示扩增获得约309 bp的特异性条带，与预期片段长度相符（图5）。

SHV基因PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，紫外光观察，显示扩增得到约176bp的特异性条带，与预期片段长度相符（图6）。

3.2.2 测序结果 将SHV基因测序结果与NCBI上收录的SHV基因序列（blaSHV-154，gb|JX121121.1|）进行比对，同源性为97%，可以确定扩增基因为SHV基因。

将TEM基因测序结果与NCBI上收录的TEM基因序列（TEM，gb|KF963580.1|）进行比对，同源性为99%。可以确定扩增的基因为TEM基因。

4 结论

从死亡东北虎的肾脏成功分离出金黄色葡萄球菌；该分离菌株对β-内酰胺类药物：头孢噻肟、阿莫西林和氨苄西林等耐药；对四环素、克林霉素、强力霉素、阿米卡星、红霉素、恩诺沙星、庆大霉素、阿奇霉素、链霉素、环丙氟哌酸等高度敏感，对氯霉素和万古霉素中度敏感；从分离菌株中PCR扩增出TEM、SHV耐药基因，说明产β-内酰胺酶是导致虎源金黄色葡萄球菌对头孢噻肟、阿莫西林等β-内酰胺类抗生素产生耐药的分子机制。