肠杆菌科细菌对多黏菌素的敏感性分析

孙　丽， 郭　燕， 杨　洋， 徐晓刚， 杨　帆， 胡付品



肠杆菌科细菌对多黏菌素的敏感性分析

孙丽， 郭燕， 杨洋， 徐晓刚， 杨帆， 胡付品

摘要：目的 了解上海华山医院2014年临床分离肠杆菌科细菌构成及其对多黏菌素的药物敏感性。方法 收集该院2014 年1－8月临床分离的肠杆菌科细菌，药敏试验采用琼脂稀释法，PCR扩增blaKPC基因并行DNA测序分析，用WHONET 5.6软件对数据进行统计分析。结果 719株肠杆菌科细菌中，主要为克雷伯菌属（315/719，43.8%）和大肠埃希菌（219/719，30.4%）。克雷伯菌属、大肠埃希菌和枸橼酸杆菌属细菌对多黏菌素B和多黏菌素E的耐药率均较低（＜3%）；肠杆菌属细菌对多黏菌素B和多黏菌素E的耐药率分别为10.9%和11.1%；沙雷菌属细菌对多黏菌素B和多黏菌素E的耐药率分别为47.5%和44.7%；摩根菌属和变形杆菌属细菌对多黏菌素B和多黏菌素E的耐药率均超过90%。碳青霉烯类耐药菌株主要见于克雷伯菌属，其对美罗培南、厄他培南耐药率均高于40%，但对多黏菌素B、E耐药率分别为2.9%、2.6%；枸橼酸杆菌属和沙雷菌属细菌对厄他培南的耐药率分别为27.8%和17.9%；其他肠杆菌科细菌对碳青霉烯类的耐药率小于10%。20.7%（149/719）的菌株blaKPC基因呈阳性，主要见于克雷伯菌属（129/315，41.0%）；7株黏质沙雷菌和2株肺炎克雷伯菌同时对碳青霉烯类和多黏菌素耐药。结论 克雷伯菌属、大肠埃希菌、肠杆菌属、枸橼酸杆菌属等对多黏菌素仍保持着较高的敏感性。

关键词：肠杆菌科细菌； 碳青霉烯类耐药； 多黏菌素； blaKPC

随着碳青霉烯类药物在临床的广泛使用，碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae， CRE）的检出率在世界范围内呈现逐年上升趋势，尤其是产碳青霉烯酶CRE菌株在多个国家和地区引起暴发流行，其所致感染的临床治疗可选方案非常有限，常伴随着高病死率［1］。鉴于此，发现于1947年，后因其肾毒性和神经毒性在临床上少用的多黏菌素重新得到关注，成为临床治疗CRE所致感染的重要选择［2］。然而，已有报道显示多黏菌素耐药CRE菌株在匈牙利［3］、韩国［4］等多个国家引起暴发流行，美国CRE菌株对多黏菌素敏感性正在下降［5］，我国台湾CRE菌株对多黏菌素耐药率可达17%［6］。我国大陆地区多黏菌素目前虽未在临床上使用，但我院2009—2010年分离的82株CRE菌株中已有4株对多黏菌素耐药［7］。为了解我院临床分离肠杆菌科细菌对多黏菌素的药物敏感性，对2014年临床分离的肠杆菌科细菌对碳青霉烯类、阿米卡星和多黏菌素等抗菌药物的敏感性及碳青霉烯酶基因blaKPC的检出率进行分析，现将结果报道如下。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1 菌株来源 连续收集我院2014年1－8月临床分离的肠杆菌科细菌，剔除同一患者分离的重复菌株。药敏试验所用质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。

1.1.2 抗菌药物和试剂 药敏试验所用标准品如美罗培南、厄他培南、阿米卡星等购自中国食品药品检定研究院、多黏菌素B和多黏菌素E分别购自阿波罗生物药业有限公司和江苏正大天晴公司；药敏试验所用MH琼脂、MH肉汤为英国OXOID公司产品； PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，rTaq酶等相关试剂为日本TaKaRa公司产品。

1.2方法

1.2.1 药敏试验琼脂稀释法测定719株肠杆菌科细菌对厄他培南、美罗培南、阿米卡星、多黏菌素B和多黏菌素E 5种药物的敏感性。其中细菌对前3种抗菌药物的敏感性试验结果按2014年美国临床和实验室标准化协会（CLSI）标准进行判读［8］；多黏菌素结果根据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会标准进行判读［9］，MIC≤2 mg/L为敏感，MIC＞2 mg/L为耐药。

1.2.2 耐药基因检测 PCR方法检测blaKPC碳青霉烯酶基因，所用引物按文献设计［10］。阳性PCR扩增产物经DNA测序后比对分析以确定基因型别。本研究中CRE菌株定义为对美罗培南或厄他培南中任一种药物耐药者。

2　结果

2.1细菌及其分布

2014年1—8月共收集719株肠杆菌科细菌，包括克雷伯菌属（315/719，43.8%，其中肺炎克雷伯菌310株，产酸克雷伯菌5株）和大肠埃希菌（219/719， 30.4%）、沙雷菌属（84/719，11.7%，其中黏质沙雷菌83株，气味沙雷菌1株）、肠杆菌属（47/719，6.5%，其中阴沟肠杆菌30株，产气肠杆菌14株，日沟维肠杆菌1株，栖水肠杆菌1株，阿氏肠杆菌1株）、枸橼酸杆菌属（18/719，2.5%，其中弗氏枸橼酸杆菌9株，异型枸橼酸杆菌5株，无丙二酸枸橼酸杆菌2株，杨氏枸橼酸杆菌1株，布氏枸橼酸杆菌1株）、摩根菌属（15/719，2.1%，摩根摩根菌15株）、变形杆菌属（14/719，1.9%，其中奇异变形杆菌7株、普通变形杆菌5株、雷特格变形杆菌2株）及斯氏普罗威登菌（6株）、植生拉乌尔菌（1株）等其他肠杆菌科细菌（7/719，1.0%）。

2.2药敏试验

克雷伯菌属、大肠埃希菌和枸橼酸杆菌属细菌对多黏菌素B和多黏菌素E的耐药率较低，＜3%；肠杆菌属细菌对多黏菌素B和多黏菌素E的耐药率分别为10.9%、11.1%；沙雷菌属细菌对多黏菌素B和多黏菌素E的耐药率分别为47.5% 和44.7%；摩根菌属和变形杆菌属细菌对多黏菌素B和多黏菌素E的耐药率均超过90%。碳青霉烯类耐药菌株主要见于克雷伯菌属，其对美罗培南、厄他培南耐药率均高于40%，但对多黏菌素B、E耐药率分别为2.9%、2.6%；枸橼酸杆菌属和沙雷菌属细菌对厄他培南的耐药率分别为27.8%和17.9%；其他肠杆菌科细菌对碳青霉烯类的耐药率小于10%。7株黏质沙雷菌和2株肺炎克雷伯菌同时对碳青霉类和多黏菌素耐药，见表1。

2.3KPC型碳青霉烯酶基因检测

PCR检测及DNA测序结果显示，719株肠杆菌科细菌中，20.7%（149/719）的菌株blaKPC基因呈阳性，主要见于克雷伯菌属（129/315，41.0%）。碳青霉烯耐药菌株中blaKPC-2阳性率为70.9%（144/203），其中克雷伯菌属、沙雷菌属及枸橼酸杆菌属中blaKPC-2的检出率高，分别为79.1%（129/163）、66.7%（10/15）、80%（4/5），大肠埃希菌中blaKPC-2阳性率相对较低，仅为5.6%（1/18）。

表1　2014年临床分离肠杆菌科细菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 1 Antimicrobial susceptibility of Enterobacteriaceae strains isolated from Huashan Hospital in 2014

2.4多黏菌素耐药CRE菌株

2株肺炎克雷伯菌和7株黏质沙雷菌同时对碳青霉烯类及多黏菌素耐药，且对多黏菌素呈高水平耐药（MIC＞128 mg/L），7株黏质沙雷菌和1株肺炎克雷伯菌对阿米卡星敏感，另外1株肺炎克雷伯菌blaKPC-2阳性且对5种抗菌药物均耐药（MIC≥128 mg/L）。这7株黏质沙雷菌中blaKPC-2的检出率可高达71.4%，见表2。

表2　多黏菌素耐药CRE菌株的耐药谱及blaKPC检测结果Table 2 Antibiotic resistant pattern of polymyxin-resistant and carbapenem-resistant Enterobacteriaceae strains and blaKPCgene detection

3　讨论

CHINET细菌耐药性监测数据表明，近年来CRE菌株呈不断增长趋势，尤见于肺炎克雷伯菌，其对碳青霉烯类药物耐药率由2006年0.3%［11］上升至2013年13%［12］；我院临床分离碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌检出率由2005年0.9%急剧上升至2011年32.7%［3］。本项研究中CRE检出率较高，其中克雷伯菌属对美罗培南的耐药率高达44.1%。以上数据显示我院肠杆菌科细菌尤其是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类耐药率呈快速上升趋势。无疑我院临床抗感染治疗已面临着CRE菌株的巨大挑战。

本研究中除摩根摩根菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、普罗威登菌、黏质沙雷菌等多黏菌素天然耐药菌株［8］，其他肠杆菌科细菌对多黏菌素耐药率尚低。值得关注的是，黏质沙雷菌作为多黏菌素天然耐药菌株，其耐药率仅为44.7%，机制有待进一步探索。我国大陆地区多黏菌素尚未被审批用于临床，非天然耐药菌株中，克雷伯菌属、大肠埃希菌、肠杆菌属等中检出多黏菌素耐药菌株，可能由于基因组DNA的自发性突变，也有文献资料表明在牛乳腺炎中分离到多黏菌素耐药菌株，结合相关文献资料表明我国是世界上多黏菌素用于农业生产最多的国家之一，接受多黏菌素治疗过的牲畜也成为多黏菌素耐药菌株的一个传播源［6， 14］。

多黏菌素耐药CRE菌株感染治疗选择非常有限且常伴发高病死率，本研究中仅4.4%CRE菌株同时对多黏菌素耐药，耐药率尚低，但应引起临床重视。多项研究表明产KPC型碳青霉烯酶肠杆菌科细菌为体外多黏菌素稳定耐药常见型别，尤其是在低剂量多黏菌素诱导下更易出现［15］，近期一有关β内酰胺酶与多黏菌素耐药性关联的全球性监测项目也表明，产KPC肠杆菌科细菌对多黏菌素敏感性相对较低［16］，本研究中blaKPC基因主要见于克雷伯菌属（129/315，41.0%），且已检测出1株blaKPC阳性肺炎克雷伯菌对5种抗菌药物全耐药（MIC≥128 mg/L），尽管目前非天然耐药肠杆菌科细菌对多黏菌素仍保持着较高的敏感性，但应注意合理用药，尽量延缓产KPC肠杆菌科细菌对多黏菌素的敏感性下降。

多黏菌素天然耐药菌株中，8.3%黏质沙雷菌对碳青霉烯类及多黏菌素耐药且同时耐药菌株中blaKPC检出率可达71.4%，阿根廷耐药监测数据表明黏质沙雷菌等多黏菌素天然耐药菌在临床的感染率呈现上升趋势［17］，对这种携带可转移blaKPC耐药基因的多黏菌素天然耐药菌株，应该加强临床监测。

综上所述，我院临床分离的主要肠杆菌科细菌对多黏菌素的耐药率较低，但CRE菌株检出率高。多黏菌素虽然目前已成为临床治疗CRE菌株所致感染的重要选择，但应合理用药，尽量避免多黏菌素耐药菌株的出现甚至暴发流行。

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中图分类号：R378.2

文献标识码：A

文章编号：1009-7708（2016）03-0373-04

DOI：10.16718/j.1009-7708.2016.03.022

收稿日期：2015-11-18 修回日期：2016-03-03

基金项目：国家自然科学基金（81273559）；国家科技部“重大新药创制”科技重大专项（2012ZX09303004-001）。

作者单位：复旦大学附属华山医院抗生素研究所，卫生部抗生素临床药理重点实验室，上海 200040。

作者简介：孙丽（1990—），女，硕士研究生，主要从事细菌耐药机制研究。

通信作者：胡付品，E-mail：hufupin@163.com。

Analysis of polymyxin susceptibility in Enterobacteriaceae

SUN Li， GUO Yan， YANG Yang， XU Xiaogang， YANG Fan， HU Fupin.
（Institute of Antibiotics， Huashan Hospital， Fudan University， Key Laboratory of Clinical Pharmacology of Antibioties， Ministry of Health， Shanghai 200040， China）

Abstract:Objective To investigate the distribution and antimicrobial susceptibility of clinical strains of Enterobacteriaceae isolated from Huashan Hospital in 2014. Methods Enterobacteriaceae were isolated from January to August 2014. Antimicrobial susceptibility testing was performed by agar dilution method. The blaKPCgene was screened by PCR and DNA sequencing. Results were analyzed by WHONET 5.6 software. Results A total of 719 strains of Enterobacteriaceae were collected， of which Klebsiella spp.， and E .coli accounted for 43.8% （315/719） and 30.4% （219/719）， respectively. Resistance rates of Klebsiella spp.， E. coli，and Citrobacter spp.， to polymyxin B and polymyxin E were low （＜3%）. The percentage of the Enterobacter strains resistant to polymyxin B and polymyxin E was 10.9% and 11.1%， respectively. About 47.5% and 44.7% of the Serratia strains were resistant to polymyxin B and polymyxin E， respectively. More than 90% of the Morganella and Proteus isolates were resistant to polymyxin B or polymyxin E. The carbapenem-resistant Enterobacteriaceae strains were mainly identifed in Klebsiella isolates， more than 40% of which were resistant to meropenem and ertapenem， but only 2.9% and 2.6% were resistant to polymyxin B and polymyxin E， respectively. Ertapenem resistance was identified in 27.8% of the Citrobacter isolates and 17.9% of the Serratia isolates. Less than 10% of the other Enterobacteriaceae strains were resistant to carbapenem. Overall， 20.7% （149/719） of the isolates were blaKPCpositive， mainly in K. pneumoniae （129/315，41.0%）. Seven strains of Serratia marcescens and 2 strains of K. Pneumoniae were resistant to both carbapenems and polymyxin. Conclusions The clinical isolates of Klebsiella，E. coli， Enterobacter and Citrobacter in 2014 were still highly susceptible to polymyxin antibiotics.

Key words:Enterobacteriaceae； carbapenem-resistant；polymyxin； blaKPC