金黄色葡萄球菌耐消毒剂基因的检测

吴建国， 黄余清， 严　明， 刘成伟， 黄文祥， 贾 蓓



金黄色葡萄球菌耐消毒剂基因的检测

吴建国1， 黄余清1， 严明2， 刘成伟2， 黄文祥2， 贾 蓓2

摘要:目的 对金黄色葡萄球菌（金葡萄）的耐消毒剂基因qacA/B进行检测分析。方法 收集重庆市奉节县人民医院2014年1—12月住院患者中分离的金葡菌51株，采用药敏试验、PCR技术进行mecA和qacA/B检测，筛选出的携带有qacA/B基因的金葡菌进行spa分型，并分析相应的临床情况和对16种抗菌药物的耐药模式。结果 金葡菌中mecA和qacA/ B检测率分别为21.6%（11/51）和13.7%（7/51）；耐甲氧西林金葡菌（MRSA）菌株中qacA/B阳性率为54.5%（6/11），甲氧西林敏感金葡菌（MSSA）菌株中qacA/B阳性率为2.5%（1/40），阳性率差异有统计学意义（P＜0.05）。7株qacA/B经spa分型发现4个型，分别为t037、t091、t932、t895，其中t037有4株来源于儿科病房，其余菌株各1株，以t037型别为主。结论 该院分离出携带耐消毒剂qacA/B基因的金葡菌，MRSA携带率明显高于MSSA，并且可能至少存在1个来自院内的克隆株在儿科病房流行。

关键词:金黄色葡萄球菌； 耐消毒剂基因； qacA/B； mecA； spa分型

金黄色葡萄球菌（金葡菌）是医院感染的重要病原菌之一，尤其是耐甲氧西林金葡菌（MRSA），因其严重的多重耐药，而引起当今世界范围内的广泛关注。由于消毒剂大量使用，导致细菌对消毒剂的敏感性下降［1-2］。与抗菌药物耐药菌株一样，抗消毒剂菌株的出现可能导致医院消毒的失败，可能引起医院内耐药菌如MRSA感染的流行和传播。金葡菌耐消毒剂基因的种类至少有12种如（qacA～qacJ， smr， 及norA）［3-8］，对消毒剂的耐药与细菌携带qacA/B密切相关，尤其在MRSA菌株中广泛流行［9-12］。奉节县人民医院为地处重庆市偏远山区的县级二甲医院，本研究通过对我院2014 年1—12月分离的51株金葡菌进行mecA和耐消毒剂qacA/B基因的检测，并进行spa分型和耐药模式分析，以了解该基因在我院MRSA和金葡菌甲氧西林敏感株（MSSA）中的流行情况，有利于对金葡菌所致医院感染的控制。

1　材料与方法

1.1材料

收集奉节县人民医院2014年1—12月临床各科室分离的金葡菌51株，标本分别来自于痰液、伤口分泌物、脓液、血液等。使用法国生物梅里埃公司生产的葡萄球菌和微球菌鉴定系统API STAPH，以及乳胶凝集法快速检测金葡菌试剂Slidex Staph Plus对所收集的菌株进行鉴定。质控菌株为金葡菌ATCC25923、ATCC29213、ATCC43300，qacA/B阳性菌株TS77。

1.2方法

1.2.1 药敏试验 药敏试验采用纸片法或稀释法测定MIC，以2014年CLSI［13］评判标准，检测51株细菌对16种抗菌药物以及4种消毒剂的药敏。

1.2.2 细菌DNA提取及模板制备 取MH平皿上新鲜过夜单个菌落2～3个，混悬于浓度为10 g/ mL溶菌酶的50 μL灭菌TE液中 （pH=8.0），37℃水浴1 h，100℃煮沸10 min，14 000 r/min离心10 min后取上清液即含细菌DNA。

1.2.3 mecA基因扩增 mecA引物参照JONAS等［14］设计，上游引物 P1：5'-AAAAT-CGATGGTAAAGGTTGGG-3'（22 bp）；下游引物P2：5'-AGTTCTGCAGTACCG GATTTGC-3'（22 bp）。PCR反应体系（50 μL）：10×PCR反应缓冲液5 μL，MgCl23 μL，dNTP4 μL，DNA模板2 μL，Taq酶0.5 μL，灭菌蒸馏水加至50 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，进行30次循环，最后延伸10 min，反应结束后，将PCR产物于4 ℃保存。取5 μL PCR反应产物样品在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，紫外凝胶电泳成像并保存。PCR扩增产物由上海生工生物工程有限公司测序，将结果与GenBank中提供的序列进行比对。

1.2.4 qacA/B基因扩增 qacA引物根据Pubmed基因库中公布的基因序列用primer 5.0设计：上游引物 P1：5'-GCTGCATTTATGACAATGTT-TG-3' （22 bp）；下游引物P2：5'-AATCCCACCTACTAAAGCAG-3'（20 bp）。

1.2.5 spa分型 对16株qacA阳性的金葡菌进行spa分型，spa分型引物参照参考文献［15-16］：上游引物 P1：5'-GACGATCCTTCAGTGAGCAAAG-3’（22 bp）；下游引物P2：5'-GCAGCAATTTTGTCGGCAGTAG -3'（20 bp）。10×PCR反应缓冲液5 μL，MgCl23 μL，dNTP 4 μL，DNA模板2 μL，Taq酶0.5 μL，灭菌蒸馏水加至50 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30次循环，然后72 ℃延伸10 min， 4 ℃保存。取5 μLPCR反应产物样品加入1.5%琼脂糖凝胶加样孔中，在1×TBE中，电压110 V，时间25 min，紫外凝胶电泳成像并保存。PCR扩增产物由上海生工生物工程有限公司测序。测序结果的重复编码判读参照文献［17］，并通过spa分型的数据库（http：// www.ridom.de/spaserver）进行分型。

2　 结果

2.1基因的检测

表明mecA的携带率为21.6%（11/51），部分检测结果见图1。

2.2 MIC测定

图1　mecA基因电泳图Figure 1 Electrophoretogram of the PCR products for mecA gene

7株携带有qacA/B基因的金葡菌和参考菌株对4种常用消毒剂和头孢西丁的药敏试验见表1。

2.3基因在金葡菌中的检出率

金葡菌中qacA/B检测阳性率为13.7%（7/51）；MRSA菌株中qacA/B阳性率为54.5%（6/11），MSSA菌株中qacA/B阳性率为2.5%（1/40），差异有统计学意义（P＜0.05）；在7株qacA/B阳性菌株中6株为MRSA，1株为MSSA，阳性率差异有统计学意义（Fisher精确概率法，P＜0.05），见图2。

2.4spa 分型

7株携带有qacA/B的金葡菌的spa分型电泳图见图3。如表2所示，可见spa基因重复序列数为6～10个。将测序结果提交spa重复序列的数据库进行比对，分别定为t037、t091、t932、t895，其中t037有4株，其余菌株各1株，以t037型别为主，占的4/7。

2.5细菌分布

分析了7株携带qacA/B基因金葡菌患者的临床资料显示，感染均来自于医院内，科室分布以儿科为主，标本来源为痰，呼吸道感染传播为主，见表3。

2.6耐药模式

7株qacA/B阳性菌株对16种常用抗金葡菌药物的耐药表型进行分型，其中507、509、511和520均为A型，534、551和557分别为B、C、D 型。A型的菌株表现为对氨苄西林-舒巴坦、氯霉素、环丙沙星、红霉素、磷霉素、夫西地酸、庆大霉素、亚胺培南、莫西沙星、四环素耐药，对利奈唑胺、利福平、替考拉宁和奎奴普丁-达福普汀敏感，B型则除了对氯霉素、红霉素和四环素耐药外对其他检测抗菌药物均敏感，而C型和D型除了对磷霉素和莫西沙星敏感性不一致外其余都耐药［10］，见表4。

表1　7株qacA/B阳性株和参考菌株mecA检出率及对4种消毒剂及头孢西丁的MICTable 1 The susceptibility of 7 qacA-positive S. aureus strains and 2 reference strains to 4 disinfectants and cefoxitin in terms of minimum inhibitory concentrations and mecA status

图2　qacA/B基因检测电泳图Figure 2 Electrophoretogram of the PCR products for qacA/B gene M， marker； Lane 1-4， Lane5-7： 507， 509， 511， 520， 534， 541， 557 test strains. Lane 8： TS77， qacA/B-positive strain； Lane 9： negative stain.

图3　spa分型电泳图Figure 3 Electrophoresis for spa typing of S. aureus strains M， marker； Lane 1-7： 507， 509， 511， 520， 534， 541， 557 test strains.

表2　7株qacA/B阳性细菌SPA重复序列的特征及分型Table 2 Spa typing of the 7 strains of qacA/B-positive S. aureus based on the features of spa repetitive sequences

表3　qacA/B阳性的金葡菌临床资料Table 3 Clinical details of the qacA/B-positive S. aureus strains

表4　qacA/B阳性金葡菌对常用抗菌药物耐药模式Table 4 Resistant pattern of qacA/B-positive S. aureus strains to commonly used antimicrobial agents

3　讨论

mecA基因的检出是确证MRSA的金标准，研究结果显示mecA基因的检出率与金葡菌对头孢西丁的耐药率是一致的，药敏结果提示7株携带有qacA/B基因的金葡菌6株为mecA基因阳性菌株，消毒防腐剂类对带有qacA/B基因菌株的MIC均高于未携带该基因菌株，菌号557未检测出mecA基因，尽管消毒剂对该菌的MIC低于mecA阳性菌株，但也明显高于阴性对照菌株，表明MSSA也可携带耐消毒剂基因，提示可能增加社区金葡菌感染的传播。

我院的qacA/B检出率明显高于WEI等［18］报道的qacA/B的检测率9.1%，MRSA中qacA/B的检出率为17.1%，2006年黄支密等［19］首次报道国内MRSA菌株检出qacA/B基因，其后国内其他地区报道的检出率为38%～92%［20］，本研究与日本及2001年欧洲报道的qacA/B在MRSA的检出率44%～63%大致相当［12，21］， MIYAZAKI等［22］2007报道MRSA中qacA/B的检出率达到80%，巴西3所医院收集的74株MRSA中qacA/ B检出率为80%［22］，这些检出率的差异可能与地域不同，用药的频次、习惯及收集标本的多少有关；MRSA 中qacA/B基因的阳性检出率高，目前已经从MRSA菌株中检出多种消毒剂耐药基因（qacA/B及qacC/D家族），这可能是qacA/B等消毒剂耐药基因多位于多重耐药基因位点上，故导致MRSA对某些消毒剂的耐药性与对抗菌药物的耐药性的关联性，我们的药敏实验中也可看到MRSA菌株的耐消毒剂水平也更高于MSSA菌株，更有利于耐药菌的生存与传播，因此应当高度重视并调查耐消毒剂基因在MRSA中的传播，以降低医院感染的发生。

spa分型显示，国外MRSA主要以t001、t002为主，国内其他地区发现有t030及t037流行［23］，此次我们的研究中并未发现新的spa分型菌株，本研究对象是携带耐消毒剂基因的MRSA，但也与国内流行趋势一致，另外也说明spa分型存在很强的地域性，有助于不同地区实验室的比较。临床资料结合spa分型可以看到我院儿科可能存在医院携带有qacA/B MRSA克隆株的流行。

本研究的不足之处主要为我院存在临床标本送检率及检出率不高，因此1年时间仅收集51株，样本量小，统计结果可能出现偏倚。

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2.重庆医科大学附属第一医院感染科，重庆市传染病寄生虫病学重点实验室。

中图分类号：R378.11

文献标识码：A

文章编号：1009-7708（2016）03-0340-06

DOI：10.16718/j.1009-7708.2016.03.016

收稿日期：2015-06-15 修回日期：2015-08-15

基金项目：重庆市卫生计生委医学科研面上项目（2013-2-286）。

作者简介：1.重庆市奉节县人民医院感染科，重庆 404600； 吴建国（1973—），男，副主任医师，主要从事细菌耐药性分析及致病机制研究。

通信作者：贾蓓，E-mail：beijia2008@yeah.net。

Detection of disinfectant-resistant gene in Staphylococcus aureus

WU Jianguo， HUANG Yuqing， YAN Ming， LIU Chengwei， HUANG Wenxiang， JIA Bei. （Department of Infectious Diseases， Chongqing Fengjie County People's Hospital， Chongqing 404600， China）

Abstract:Objective To detect the disinfectant-resistant gene qacA/B in the strains of Staphylococcous aureus isolated from January 2014 to December 2014. Methods Fifty-one isolates were collected. PCR assay was used to detect mecA gene and qacA/ B gene in the isolates followed by Staphylococcus protein A （spa） typing. Antimicrobial-resistant phenotypic typing was conducted to analyze the homology of these qacA/B positive strains. The clinical information of the patients from whom the strains were isolated was collected to further understand the clinical background of qacA/B-carrying S. aureus. Results The prevalence of mecA and qacA/B genes was 21.6% （11/51） and 13.7% （7/51）， respectively in the strains. The prevalence of qacA/B gene in the methicillinresistant S. aureus strains （54.5%， 6/11） was signifcantly higher than that in the methicillin-sensitive S. aureus strains （2.50%， 1/40）. The prevalence of mecA gene in qacA/B gene positive strains （6/7） was signifcantly higher than that in qacA/B gene negative strains （1/7）. These qacA/B positive strains were classifed into 4 spa types （t037， t091， t932 and t895）. The main type was t037 （4/7）， which was from the pediatric ward. Conclusions The prevalence of qacA/B gene is low in the S. aureus strains. However， the prevalence of this gene in methicillin-resistant S. aureus strains is far higher than that in methicillin-sensitive S. aureus. spa type t037 may be a prevalent clone in pediatric ward.

Key words:Staphylococcus aureus； disinfectant-resistant gene； qacA/B； mecA； spa typing