细胞代谢组学用于辐照干预肺癌细胞A549的机制研究

郑庆辉

细胞代谢组学用于辐照干预肺癌细胞A549的机制研究

郑庆辉

目的 研究电离辐射抑制肺癌细胞系A549细胞的作用机制。方法 应用核磁共振氢谱的代谢组学方法，分析辐照后A549细胞系和正常A549细胞系的变化。结果 经分析得到乳酸、甘油、丙氨酸、葡萄糖、甘氨酸、肌酸、磷酸肌酸、 UDP-葡萄糖、ATP等9种代谢差异物。结论 电离辐照主要通过抑制DNA合成和底物磷酸化生成ATP反应来抑制A549细胞的增殖。从细胞代谢组学角度为放疗的杀伤机制提供新的认识。

电离辐射 细胞代谢组学 增殖 抑制

放射治疗是利用一种或多种电离辐射对恶性肿瘤及一些良性病进行治疗，然而放射治疗肿瘤属于随机性杀伤，其主要通过产生自由基的方式作用于肿瘤细胞周期，从而起到杀伤作用［1］。本文通过细胞代谢水平分析，在小分子代谢物变化基础上，探讨放疗杀伤细胞的机制。

1　 材料和方法

1.1 仪器与试剂 AVANCE III 600 MHz核磁共振谱仪（Bruker公司），生物学X-ray辐照仪（Rad Source），Concentrator plus浓 缩 仪（Eppendorf）， 真空冷冻干燥机（中国 北京博医康实验仪器），培养箱（Thermo Fisher Scientific），SORVALL ST16R离 心 机（Thermo Fisher Scientific）。Gibco RPMI-1640干粉（Life Technologies），HyClone胎牛血清（Thermo Scientific），甲醇（天津科密欧），氯仿（天津科密欧），氘代水（Cambridge Isotope Laboratories）。

1.2 细胞培养 在完全RPMI-1640培养液 （含10%胎牛血清 + 1%双抗） 中培养肺癌细胞系A549。经亚致死量 （18 Gy） X线辐照后（处理组）传代至25cm2培养瓶中，37℃ 5% CO2培养箱中培养48h，未处理的A549细胞在相同条件下培养作为对照组。

1.3 细胞内代谢物样品收集 取生长适宜的细胞，倒掉培养基，冰磷酸盐缓冲液（pH 7.4，4℃，PBS）洗2遍。加入2ml-20℃预冷的甲醇。使用细胞刮刀刮下细胞。将甲醇中淬灭的细胞移至15ml离心管中，加入2 ml-20℃预冷的氯仿和冰上预冷的纯水 （体积比1：1：0.7）。涡旋5min混匀后静置15min，4℃，12000r/min离心30min，形成两相萃取液［2，3］，保留其中水相用于NMR分析。真空冻干机将样品冻干后进行NMR检测。用450μl氘代水+50μl缓冲液 （1.5M磷酸氢二钾 + 0.375 M磷酸二氢钠，pH 7.4，含0.1%TSP、0.2%叠氮钠） 溶解样品［4］。涡旋混匀后4℃，12000r/ min离心5min去除不溶物。将上清液移至5mm核磁管待测。

1.4 1H核磁波谱采集条件 使用Bruker AVANCE III 600 MHz核磁共振谱仪在298.15K温度下检测。压制水峰脉冲序列noesypr1d （［RD-90°-t1-90°-tM-90°-ACQ］） 检测样品。弛豫延迟设为3s，t1设为4μs，混合时间tM设为120ms，采样时间为1.64s。在TOPSPIN软件中采集256次自由感应衰减（FIDs），保留32k数据点，充零至64k，谱宽为10 kHz。所有FIDs乘以线宽1 Hz的指数函数加窗，经傅里叶变换，得到波谱信号数据。

1.5 波谱数据预处理 在MestReNova软件中调整所有NMR谱的相位和基线，将TSP峰设置为0 ppm，以0.002 ppm为区间计算分段积分 （bin） 后导出为文本。在自编MATLAB脚本中进行数据预处理。保留0.6～9.5 ppm的数据点，将水峰 （4.5～5.2ppm） 区间移除。每个谱均保留4500个bins。经过概率商归一化 （PQN） 处理，根据参照谱计算各样品的稀释因子，减少样品浓度不同导致的差异［5］。统计全相关谱根据预处理后的数据绘制二维谱，显示各化学位移之间的相关关系［6］。相关系数r的阈值根据Bonferroni校正P值和变量数计算，降低假阳性的概率。

2　 结果

2.11HNMR谱与模式识别分析显示辐照处理的A549代谢特征 通过Chenomx NMR Suite软件，结合统计全相关谱 （STOCSY） 确定谱中主要的代谢物，化学位移和相应归属的基团（见表1）。数据首先经过主成分分析 （PCA）比较，显示样品在主成分空间中的分布。得分图中可见辐照后的A549细胞和未处理A549细胞在第一主成分上 （PC1） 能够区分，辐照后的A549细胞的代谢特征与未照射细胞相比存在差异（见图1A）。然后使用有监督的模式识别算法进行分析，首先用偏最小二乘判别分析建模，得分图中能在第一主成分上能够区分辐照与未辐照细胞（见图1B）。经过400次交叉验证，模型无过拟合现象，数据预测能力好（见图1C）。在PLS-DA模型可靠的基础上，通过旋转主成分投影滤去无关信息，建立OPLS-DA模型，使两组样品在预测主成分上得到最大区分（见图1D），通过各变量的VIP、相关系数r和荷载值loading筛选区分两组样品的差异代谢物。根据VIP和相关系数r绘制荷载图并显示差异物质的变化方向 （见图1E）。其中：丙氨酸（Alanine）、葡萄糖（Glu）、甘氨酸（Glycine）、牛磺酸（Taurine）、肌酸（CR）、磷酸肌酸（CP）、UDP-葡萄糖、ATP在辐照后细胞内含量降低，乳酸（Lactate）、乙二醇（Ethylene glycol）、甘油（Glycerol）在辐照后细胞内含量升高。

表1 化学位移和相应归属的基团

图1 多变量分析图和载荷图

2.2 细胞内代谢物改变 单变量分析辐照后细胞内升高的物质包括乳酸（Lactate）、甘油（Glycerol），降低的物质有丙氨酸（Alanine）、葡萄糖（Glu）、甘氨酸（Glycine）、肌酸Creatine （CR）、磷酸肌酸（Creatine Phosphate CP）、 UDP-葡萄糖、ATP，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

3　 讨论

放疗主要通过电离辐射的能量产生自由基和活性氧reactive oxygen species （ROS），对处于M期和G2期的细胞造成DNA损伤，造成G2/M期阻滞，使细胞停止生长，诱导其凋亡，从而达到杀伤肿瘤的作用［13～16］。甘氨酸可经甘氨酸羟甲基转移酶催化与5，10-亚甲基四氢叶酸反应，生成丝氨酸和四氢叶酸，后者是DNA合成过程中重要的辅酶。本资料中甘氨酸在辐照处理的A549细胞中降低，提示A549甘氨酸合成四氢叶酸减少，进而导致DNA合成功能受损，最终使细胞增殖能力减弱。

本文辐照后的A549细胞中，谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸含量降低结合生物信息学分析提示AST、ALT、AGT 三个氨基转移酶［17］在辐照后其活性降低，DNA合成活性降低。同时磷脂酰胆碱 （PC）是生成细胞膜的重要原料之一，其降低也提示细胞膜合成能力降低，最终影响细胞增殖能力。

ATP作为细胞直接的供能物质，在辐照后含量降低，提示辐照后的A549细胞通过底物水平磷酸化合成ATP的能力减弱，细胞直接供能障碍导致细胞生长缓慢。同时乳酸在辐照后的A549细胞中增多，提示细胞进行大量的无氧呼吸供能，降低供能效率，从侧面反应细胞的供能障碍。

本资料中，在A549细胞中发现一系列辐照后改变的代谢物，进一步分析发现，辐照后的A549细胞DNA合成障碍，导致细胞增殖能力减弱，同时辐照后的A549细胞有氧呼吸减弱，导致ATP生成减少，影响细胞的正常生长。基于核磁共振的代谢组学能够用于寻找细胞经过辐射处理后受到干扰的关键代谢物，寻找不同肿瘤放疗的具体机制，为进一步放疗研究提供新的方法和思路，为个体化治疗提供技术支撑和理论依据，有很好的应用前景。

1 Su X， G JIN， L XUE， Effect of ionizing radiation on cell cycle of tumor cell lines. CHINESE JOURNAL OF RODIATION MEDIATION AND PROTECTION， 2000，3： 009.

2 Teng Q， W Huang， TW Collette， et al.A direct cell quenching method for cell-culture based metabolomics. Metabolomics， 2009. 5（2）：199～208.

3 Lorenz M A ， CF Burant， RT Kennedy.Reducing time and increasing sensitivity in sample preparation for adherent mammalian cell metabolomics. Anal Chem， 2011，83（9）：3406～3414.

4 Xiao C， F Hao， X Qin， et al. An optimized buffer system for NMR-based urinary metabonomics with effective pH control， chemical shift consistency and dilution minimization. Analyst， 2009. 134（5）： 916～925.

5 Dieterle F， A Ross， G Schlotterbeck， et al. Probabilistic quotient normalization as robust method to account for dilution of complex biological mixtures. Application in 1H NMR metabonomics. Anal Chem， 2006，78（13）： 4281～4290.

6 Cloarec O， M E Dumas， A Craig， et al. Statistical total correlation spectroscopy： an exploratory approach for latent biomarker identification from metabolic 1H NMR data sets. Anal Chem， 2005，77（5）：1282～1289.

7 Van den Berg R A， H C Hoefsloot， J A Westerhuis， et al.Centering，scaling， and transformations： improving the biological information content of metabolomics data. BMC Genomics， 2006，7：142.

8 Lindon J C ， E Holmes， J K Nicholson. Metabonomics techniques and applications to pharmaceutical research & development. Pharm Res，2006，23（6）：1075～1088.

9 Westerhuis J A ， H C Hoefsloot， S Smit， et al.Assessment of PLSDA cross validation. Metabolomics， 2008. 4（1）： p. 81～89.

10 Szymanska E.， E. Saccenti， A.K. Smilde， et al. Double-check：validation of diagnostic statistics for PLS-DA models in metabolomics studies. Metabolomics， 2012， 8（Suppl 1）： 3～16.

11 Bartel J.， J. Krumsiek， F.J. Theis. Statistical methods for the analysis of high-throughout metabolomics data. Comput Struct Biotechnol J，2013，4：e201301009.

12 Boccard， J. D.N. Rutledge， A consensus orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA） strategy for multiblock Omics data fusion. Anal Chim Acta， 2013， 769：30～39.

13 Gillette E.L.， S.M. Gillette. Principles of radiation therapy. Semin Vet Med Surg （Small Anim）， 1995，10（3）：129～134.

14 Fang Y.Z.， S. Yang， G. Wu. Free radicals， antioxidants， and nutrition. Nutrition， 2002， 18（10）： p. 872～879.

15 Borek C. Antioxidants and radiation therapy. J Nutr， 2004，134（11）：3207S～3209S.

16 Lomax M.E.， L.K. Folkes， P. O'Neill. Biological consequences of radiation-induced DNA damage： relevance to radiotherapy. Clin Oncol （R Coll Radiol）， 2013，25（10）： 578～585.

17 Willers H.， C.G. Azzoli， W.L. Santivasi， et al. Basic mechanisms of therapeutic resistance to radiation and chemotherapy in lung cancer. Cancer J， 2013，19（3）：200～207.

Objective To explore the mechanism of ionizing radiation's inhibitary effects on the lung carcinoma A549 cell line. Methods The metabolome of nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum was applied to analyze the change of A549 cell line. Results The product of metabolism were obtaine，ie. lactic acid， glycerin， anlanine，glucose， glycine， creatine， creatine phosphate， UDP-glucose and ATP. Conclusions The ionizing radiation suppressed the proliferation of A549 cell by suppressing the DNA synthesis and ATP producing through substrate phosphorylation， which provides a novel mechanism for radiotherapy from the angle of cellular metabolome.

Ionizing radiation Cellular metabolome Proliferation Inhibit

530000 广西医科大学

1.6 模式识别分析 在SIMCA-P+软件 （Ver. 12.0，Umetrics，Umeå，Sweden） 中导入预处理后的数据进行模式识别分析和多变量分析。数据经过Pareto变换减少样品中不同物质浓度差异造成的变异［7］。首先用一种非监督模式识别方法-主成分分析 （PCA） 对数据做降维处理，得到数据的预览［8］。之后用偏最小二乘判别分析 （PLS-DA），一种有监督的模式识别方法，将分组做为响应变量Y进行建模，将使辐照样品和未处理样品得到最大区分。软件计算得到模型的Q2 和R2分别用于评价模型的拟合程度和预测能力。经过400次7-fold交叉验证，避免出现过拟合［9～11］。通过验证的模型经正交偏最小方差判别分析 （OPLS-DA）算法建模，滤去无关噪声同时使两组数据在得分图上能够最大区分［12］。导出模型的相关系数和变量重要性投影 （VIP） 以及荷载值，回溯变换后绘制荷载图并对差异代谢物进行鉴定和指认。

1.7 统计学方法 采用GraphPad Prism 6软件。计量资料用（±s）表示，用t检验。对模式识别筛选出的差异物质和其它谱图中指认出的物质进行单变量分析。P＜0.05为差异有统计学意义。