补肾活血方对早期激素性股骨头坏死血液粘滞性基因表达影响的研究

耿艳华 王昌兴 石仕元 董黎强 谢文君 赵毅

补肾活血方对早期激素性股骨头坏死血液粘滞性基因表达影响的研究

耿艳华 王昌兴 石仕元 董黎强 谢文君 赵毅

目的 探讨补肾活血方对激素性股骨头坏死大鼠病变早期血液粘滞性基因表达及病理生理改变的影响。方法 成年健康SD大鼠30只，随机分成实验组，中药组以及对照组。实验组及中药组先予腹腔注射内毒素20g/kg，间隔24h，分2次注射，然后肌注甲强龙40mg/kg，连续注射3次，间隔24h。造模后中药组予补肾活血方灌胃，实验组及对照组均用等量0.9%氯化钠注射液灌胃，分别在造模后第3周处死大鼠，取大鼠左侧股骨头洗净、做矢状对半分开，一半行石蜡包埋、制备组织病理HE切片，另一半行基因芯片制作、分析及荧光定量PCR检测。结果 组织病理学检测显示骨髓腔未见扩张，营养血管充盈情况良好，血管密度轻度增加。骨小梁间基质未见萎缩、退变，关节软骨厚度、细胞成熟度、生发层次序及生长板上中药组均好于实验组，并接近于正常对照组组织。基因芯片结果显示，中药组与实验组比较，ASPG，CRISPLD2和PLA2G2A的表达均明显增高（倍数变化＞2），差异有统计学意义；荧光定量PCR检测结果显示，中药组三种基因ASPG，CRISPLD2和PLA2G2A表达均显著高于实验组（P＜0.01），差异有统计学意义。结论 激素性股骨头坏死早期相关血液粘滞性基因表达均出现明显下调，提示信号传导分子基因ASPG，CRISPLD2和PLA2G2A是早期的SNFH发生、发展过程中起作用的关键基因。补肾活血方能有效恢复股骨头血液粘滞性相关基因表达的改变，促进骨代谢动态平衡恢复，使早期股骨头病损得以及时修复。

激素性股骨头坏死 血粘度 SD大鼠 补肾活血 基因表达

激素性股骨头是坏死是现今临床骨科常见疾病，目前发病率已超过外伤所致的股骨头坏死。目前该病的治疗方法较多，而中药治疗也是其热点之一。补肾活血中药可以促进血供改善和骨髓基质干细胞向成骨细胞分化，抑制骨髓源性破骨细胞的生长。本实验用诱导激素性股骨头坏死模型研究病变初期进行中药干预情况下，大鼠股骨头组织病理学以及血粘度相关基因表达变化，进一步探讨补肾活血方对激素性股骨头坏死早期血粘度基因表达调节变化和病理生理改变，为早期治疗股骨头坏死、指导临床诊治以及中医新药的研发提供相关理论依据。

1　 材料及方法

1.1 实验动物分组及造模 健康SD大鼠，体重（200±10）g，30只，由浙江中医药大学实验动物中心提供。将上述大鼠随机分为实验组，中药组，对照组各10只，所有大鼠在同一条件下饲养。实验组予内毒素20g/kg注射，间隔24h，分2次注射，再间隔24h，注射甲强龙40mg/kg，连续注射3次，间隔24h。中药组前5d处理同实验组，第6天开始予补肾活血汤灌胃。对照组，连续5d等量0.9%氯化钠注射液灌胃，正常饲养。所有大鼠均于第3周处死，使用脊髓脱臼法处死大鼠，沿腹部向下剪开，显露耻骨联合，沿矢状位剪断耻骨联合和髋关节剪开关节囊，将股骨头完整分离出来，并去除其周围的软组织，用咬骨钳沿股骨颈以及股骨粗隆部离断，取出大鼠左侧股骨头洗净、做矢状对半分开，一半以10%中性福尔马林固定，EDTA-Na （pH7.4） 脱钙，石蜡包埋，制备组织病理HE切片，对另一半以DEPC漂洗，冷冻存储，液氮罐转入-80℃冰箱以制备基因芯片分析及荧光定量PCR检测。

1.2 实验药品 （1）中药补肾活血方制备：采用三七6g、当归15g、血竭9g、川芎10g、生地30g、赤芍15g、枳壳10g、川断10g、骨碎补20g、补骨脂12g、枸杞子6g、地鳖虫9g组成补肾活血方。（2）制备方法：称取30倍量的处方加入适量的水浸泡，然后加入10倍量的水放入密闭式高压自动煎药机中煎煮，先后3次，将所得药液混合，趁热过滤，2次冷藏、离心后，再浓缩、减压干燥、碾细，筛得补肾活血汤细粉。实验灌胃时将补肾活血汤细粉溶化至含生药2g/ml备用。（3）动物用药的换算：根据公式：A动物剂量=B动物剂量（mg/kg）×A动物的体表面积比值/B动物的体表面积比值及赵金东［1］报道的激素性股骨头坏死造模法，大肠杆菌内毒素大鼠的剂量约为20g/kg；甲基强的松龙大鼠用量约为40mg/kg。

1.3 组织病理学观察 股骨头放入10%中性甲醛固定，EDTA-Na脱钙，乙醇脱水，石蜡包埋切片，切片厚4μm，HE染色，光镜下观察形态学变化。

1.4 基因芯片分析 基因芯片制作及检测委托上海伯豪生物技术有限公司完成。

1.5 荧光定量PCR检测 采用比较Ct值法进行相对定量的数据分析。

1.6 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　 结果

2.1 股骨头HE染色观察 实验组：骨髓腔萎缩，营养血管充盈减少，官腔血管密度减低，髓腔血管上移至关节面下。骨小梁间基质增宽、退变，关节软骨厚度变薄、细胞成熟度欠佳且不均衡、细胞数减少，软骨生发层萎缩伴有次序紊乱，生长板消失，营养血管供血下降（见图1、2）。中药组：大鼠股骨头骨髓腔未见扩张，营养血管充盈情况良好，血管密度轻度增加，供血良好。骨小梁间基质未见萎缩、退变，关节软骨厚度接近正常，软骨细胞成熟，生发层萎缩不显著，生发层次序存在及生长板有残留（见图3、4）。对照组：大鼠股骨头骨髓腔未见扩张，营养血管充盈情况良好，血管密度，供血好。骨小梁间基质未见萎缩、退变，大鼠股骨头关节表面软骨厚度正常，软骨细胞成熟，生发层正常，生发层萎缩不显著，生发层次序好及生长板明显（见图5、6）。

图1 实验组骨髓腔缩小（HE×10）

图 2 实验组关节软骨发育不良（HE×10）

图3 中药组骨髓腔未缩小（HE×10）

图4 中药组关节软骨发育（HE×10）

图5 对照组骨髓腔扩张（HE×10）

图6 对照组关节软骨成熟（HE×10）

2.2 基因芯片检测结果 实验组比对照组ASPG、CRISPLD2和PLA2G2A表达明显下降 （ fold change＞2），中药组较实验组则显著上调，差异均有统计学意义。

2.3 荧光定量PCR检测 中药组ASPG、 CRISPLD2和PLA2G2A与对照组大致相同，但比实验组高，差异有统计学意义（P＜0.05），表明补肾活血方对于激素性股骨头坏死的治疗切实有效，且效果较为明显。见表1。

表1 3组ASPG、CRISPLD2和PLA2G2A基因在股骨头组织中的相对定量表达值

3　 讨论

3.1 补肾活血方对骨坏死的治疗作用 补肾活血方在治疗骨质疏松症的疗效已得到大量实验研究及临床疗效的证实［2］。近年相关研究较多，证实补肾活血中药具有促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化功能。胡黎平等［3］在补肾方剂对大鼠骨髓基质干细胞增殖与分化的影响的实验研究认为补肾方剂可以促进骨髓基质干细胞的增殖、分化及矿化。也有学者［4］在补肾方剂对大鼠成骨样细胞增殖及相关酶类的影响的研究中发现补肾方剂在一定的浓度范围均能增加成骨样细胞增殖，认为补肾方剂可活跃和增进信号传导，可能是其促进细胞增殖的一种机制。且补肾活血中药可以提高骨髓中多种活血、成骨有关因子的表达［5］，还可以抑制骨髓源性破骨细胞的生成［6］。

3.2 早期股骨头坏死血液粘调性相关基因异常表达的意义 研究认为ASPG参与凝血过程的改变。早期的SINFH模型凝血功能下降，推测其低表达直接或间接参与影响凝血过程。有研究显示肝脏60-kDa溶血磷脂酶包含了一个天冬酰胺酶样区和锚蛋白重复序列。当转染大鼠cDNA编码的溶血磷脂到HEK293细胞时发现不仅溶血磷脂的活性被表达，天冬酰胺酶和血小板激活因子乙酰水解酶的活性也被表达［7］。不同的锚蛋白重复序列涉及组织的分化和细胞周期的控制，这个锚蛋白重复序列一个主要功能是蛋白质相互作用［8］，重要的是近来也显示包含一个非钙依赖的磷脂酶A［9］。锚蛋白重复在非钙依赖的磷脂酶A2显示通过低聚复合物的形成参与影响酶活性。这种酶可能与其他可以调节酶的活性蛋白质以复合物的形式存在。识别和描述这样的结合蛋白在认识60-kDa溶血磷脂酶的调节和生理机能上提供了有用的信息。这些氨基酸在60-kDa溶血磷脂酶的催化活上性起着关键作用，且Thr116作为亲核物质涉及酰基酶中间物的形成，有报道称Thr116Asn是早老素presenilin-1 的一个突变体或替代物［10］，可见在早期SINFH大鼠模型中天冬酰胺酶和磷脂酶A2互相作用，共同影响着凝血活性、组织分化和细胞周期的变化，并于这个过程中出现了与致病基因有关的早老性改变，而本资料中，补肾活血方剂在SINFH大鼠病变早期的应用可能改变了这个过程。

PLA2是一种能催化磷脂甘油分子上二位酰基的水解酶，亦是花生四烯酸（AA）、前列腺素及血小板活化因子（PAF）等生物活性物质生成的限速酶，所产生的脂质介质在炎症和组织损伤时活化膜通道、信息传递、改变血流动力学及病理生理过程，并在调节细胞内外代谢中起关键性作用［11］。有研究表明多重磷脂酶A2 参与骨关节炎软骨组织中的炎症过程，炎症因子IL-1β，TNF 和 PAF 诱导PLA2的释放，在骨关节炎时诱导软骨细胞sPLA2-IID 释放是个新发现［12］。本资料显示病变早期除PLA2低表达导致血液粘滞性下降外，还出现因此而致的关节软骨损伤，说明这些因素的确参与了动物早期模型的建立过程，但在中药实验组中被活血补肾汤剂明显逆转。

研究表明CRISPLD2的表达并不能改变疾病严重程度，CRISPLD2 水平可能潜在反映宿主对感染的反应，调节CRISPLD2表达失败表明感染已经进入严重阶段并失控。传统脓毒症治疗的一个缺点是一旦检测到内在休克的指征，免疫事件的雪崩式触发就以全帧速率进行，其再也不能停止，并被逆转［13］。这有力地证明疾病一旦触及CRISPLD2的临界阈限，免疫抑制将进入一个不可逆过程。中药治疗组中差异性表达基因的连续上调提示在其出现差异性表达前就给予中药制剂对疾病的治疗和恢复是至关重要的，证明最有效的治疗方式是阻止差异性基因塌方式的启动。激素性股骨头坏死早期相关信号传导分子基因表达均出现明显下调，提示ASPG，CRISPLD2和PLA2G2A在早期的SINFH血液粘调度改变过程中起关键作用。补肾活血方能有效恢复股骨头血粘度相关基因表达的改变，促进骨代谢动态平衡恢复，促进早期股骨头病损的修复。

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3 胡黎平， 涂平生， 谢富康. 补肾方剂对大鼠骨髓基质干细胞增殖与分化的影响. 中国药物与临床， 2007， 7（5）： 329～331.

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13 Wang ZQ， Xing WM， Fan HH， et al. The novel lipopolysaccharide -binding protein CRISPLD2 is a critical serum protein to regulate endotoxin function. J Immunol， 2009， 183： 6646～6656.

Objective To investigate the treatment of early Steroid-induced necrosis of femoral head （SINFH） by Bushen Huoxue decoction，and research the effect on the regulation changes of Gene expression of blood viscosity and correlation with pathomorphology. Methods 30 adult healthy SD rats were involved in this research and randomly divided into experimental group，Chinese medicine group and the control group. The experimental group and Chinese medicine group were intraperitoneally injected endotoxin 20g/kg per day for twice，and then intramuscular injected methyl prednisolone 40ml/kg per day for thrice. After building，Chinese medicine group was given Bushen Huoxue decoction 2ml per day by fi lling the stomach，while the experimental group and control group with the equivalent 0.9% normal saline. All the rats were sacrifi ced in 3 weeks after building. The left femoral heads were stripped neatly and dissected immediately from the coronal plane，and then half of were preparing for the gene chip analysis and fl uorescence quantitative PCR detection. The other half were prepared for paraffi n embedding and sectioned and stained with H& E. Results Histopathological test showed the marrow cavity wasn't expansion but with slight density increasing of blood vessel，blood supply was good，the situation no matter from articular cartilage thickness of femoral head，maturity of cartilage cells，germinal layer showed in Chinese medicine group were better than that of the experimental group，and close to the normal control group. According to the results of Gene chips，compared to the experimental group，the Chinese medicine group had a signifi cant high expression of ASPG，CRISPLD2 and PLA2G2A （fold change＞2）. The results of fl uorescence quantitative PCR detection show that the Chinese medicine group of three genes ASPG，CRISPLD2 and PLA2G2Aexpression were signifi cantly in the experimental group（P＜0.01）. Conclusion Signaling molecule gene expression are signifi cantly lower in the initial stage of steroid-induced avascular aseptic necrosis of femoral head，prompting that ASPG，CRISPLD2 and PLA2G2A were the key genes in the process of SNFH's occurrence and development. The Bushen Huoxue decoction can effectively restore the femoral head signaling molecule gene related with blood viscosity，promote bone metabolic dynamic balance recovery，repair the early femoral head necrosis.

Steroid-induced femoral head necrosis blood viscosity gene chip Bushen Huoxue Decoction SD rats

浙江省科技厅项目（N20120675、2012C33035）

310003 杭州市红会医院（耿艳华 石仕元 谢文君赵毅）310005 浙江中医药大学附属第二医院（王昌兴 董黎强）