羟喜树碱抗宫颈癌的机制研究

程艳香 陈干涛★

羟喜树碱抗宫颈癌的机制研究

程艳香 陈干涛★

目的 探讨羟喜树碱（HCPT）对宫颈癌HeLa 细胞作用的机制。方法 利用western blot、GFP-LC3 shRNA转染、Hoechst染色等对经HCPT处理后的HeLa 细胞进行自噬和凋亡水平的观察。结果 western blot、荧光显微镜的结果均提示，HCPT能够诱导HeLa 细胞中自噬相关基因Beclin-1、p62以及LC3 的表达增加，从而激活细胞自噬发生；除细胞自噬外，HCPT也可以造成细胞的凋亡，且凋亡出现在自噬触发之后。结论 HCPT能够激活宫颈癌HeLa细胞发生自噬，进而诱导细胞凋亡达到抗肿瘤目的。

羟喜树碱 宫颈癌 自噬 凋亡

宫颈癌（Cervical cancer）是女性生殖道最常见的恶性肿瘤。宫颈癌的治疗一般采用手术和放疗为主、化疗为辅的综合治疗方案。其预后与临床期别、病理类型等密切相关，有淋巴结转移的患者预后较差［1］。自噬是真核细胞的一种非细胞凋亡性程序性死亡，又被称为Ⅱ型程序性细胞死亡。自噬现象可能成为包括宫颈癌在内的肿瘤药物治疗的新靶点［2，3］。羟喜树碱（HCPT）是唯一有选择性抑制DNA Topo I作用的植物类特异性肿瘤化学治疗药物，有望成为治疗恶性肿瘤（包括宫颈癌）一种有效药物［4］。本实验旨在研究HCPT对HeLa细胞在自噬与凋亡方面的影响，从细胞信号传导通路的角度探讨其作用机制。

1　 材料与方法

1.1 材料 人宫颈癌细胞系HeLa细胞购自中国科学院上海细胞库；羟基喜树碱（HCPT）购自美国Santa Cruz公司；RPMI 1640细胞培养液及胎牛血清购自美国Life Technologies公司；GFP-LC3质粒由南京医科大学基础医学院惠赠。Beclin-1，p62，LC-3B，GAPDH等抗体购自美国santa cruz公司； Bax，Bcl-2，cleavecaspase3抗体购自英国Abcam公司。

1.2 方法 （1）细胞计数法检测细胞活力 采用细胞活力检测试剂盒（CCK8）法检测细胞活力。以5000 个/孔的密度将HeLa接种于96孔培养板中，12h后，分别加入1，2，4，6，8，10μM羟喜树碱，每浓度组设6个复孔，同时设立生理盐水作阴性对照；置于37℃培养箱中继续培养24h。24h后每孔加入10μl 的CCK-8溶液，放置37℃培养箱继续培养2h，采用ELX-800型酶标仪（美国Bio-Tek公司）测定各孔450 nm处的吸光度（a）值。细胞抑制率=1-（用药组a值/对照组a值）。通过拟合函数曲线计算药物处理的半数抑制浓度即IC50。（2）Western blot法检测自噬与凋亡相关蛋白表达 将HeLa细胞均匀接种于60mm培养皿中，药物处理后用预冷的PBS洗3遍，加入含有100 mmol/L PMSF的裂解液（RIPA）裂解细胞，冰上放置30min充分裂解，4℃条件下12000 r/ min离心15min，取上清液后经BCA法测定蛋白浓度。依次进行质量分数10%SDS-PAGE凝胶电泳，使用PVDF转膜，5%脱脂奶粉封闭2h后，4℃封闭一抗过夜，TBST清洗3次（5min/次）后加入相应二抗，室温下孵育60min，TBST洗3次后进行显影，实验重复2次，采用计算机软件ImageJ分析灰度值并记录。（3）细胞凋亡形态学变化的观察 将HeLa细胞接种于6孔板中，每孔1×106，培养过夜，加入相应的药物分别处理12h和24h，同时设立对照组；细胞经PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定15min，加入Hoechst33342（杭州碧云天生物科技有限公司）避光孵育10min，PBS清洗3遍后，在荧光显微镜（日本Olympus公司）下观察细胞核形态并统计记录。（4）细胞自噬率检测 将HeLa细胞接种到6孔板内，培养过夜，使细胞密度达到60%～70%。通过lipofectamine 2000（美国Life Technologies）转染GFP-LC3质粒体，6h后换完全培养基继续培养24h。之后加入羟基喜树碱分别作用12h和24h，PBS清洗3次，用4%多聚甲醛室温固定15min，PBS清洗3次，荧光显微镜下观察对GFP-LC3的阳性自噬点数进行统计，统计对照组和处理组单个细胞中GFP-LC3点荧光数，每组统计≥25个细胞。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，两两比较采用LSD-t检验和SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　 结果

2.1 HCPT对HeLa细胞具有毒性作用 不同浓度的HCPT作用于HeLa细胞，结果表明，HCPT对细胞具有明显的生长抑制作用。其IC50约 为3μM。本实验 选 取IC50即3μM浓度的HCPT探究其作用机制。见图1。

图1 不同浓度HCPT对HeLa细胞的生长抑制作用

2.2 HCPT能够诱导HeLa细胞自噬蛋白表达变化 给予HeLa细胞以3μM浓度的HCPT分别处理12h和24h，通过western blot检测，结果显示，自噬标记蛋白Beclin1表达量增加，而自噬底物标记蛋白p62出现降解，作为自噬发生指标的LC3-II/LC3-I比值也同样表现出上升，western blot结果表明，HCPT能够引起HeLa细胞自噬，并随药物的作用时间的延长自噬水平也出现升高。见图2。

图2 HCPT（3μM）诱导细胞自噬水平增加

2.3 HCPT引起HeLa细胞中GFP-LC3点状分布增加 GFP-LC3目前被认为是自噬体特异性标签。是一种检测自噬发生常用的实验技术手段，将HeLa细胞转染GFP-LC3后，用HCPT分别处理12h和24h，在荧光显微镜下观察并对带有GFP-LC3的自噬点阳性细胞数和总细胞数进行统计。结果显示，相对于对照组的细胞，HCPT能够明显增加细胞自噬体的数量，进一步证明HCPT可以诱发HeLa细胞自噬发生。见图3。

图3 荧光显微镜观察经HCPT处理后HeLa中GFP-LC3自噬点的分布变化

2.4 HCPT诱导HeLa细胞凋亡的形态变化 给予HeLa细胞以3μM浓度的HCPT分别处理12h和24h，经过固定，Hoechst33342染色，在荧光显微镜下观察发现，与对照组比较，24h处理组细胞出现细胞核皱缩，染色加深等凋亡形态，而12h处理组并未出现明显细胞核变化，结果表明，3μM 的HCPT在处理24h细胞后可引发细胞凋亡，而12h作用并不明显。提示HCPT引发的细胞凋亡是在细胞出现自噬后所引起的。见图4。

图4 HCPT诱导HeLa细胞凋亡的形态学变化影响

2.5 HCPT诱导HeLa细胞凋亡相关蛋白变化 为进一步证实HCPT所引发的细胞凋亡现象，通过western blot方法检测细胞凋亡相关蛋白的变化，结果显示，在细胞处理24h组中，细胞凋亡相关蛋白Bax 与cleave-caspase-3均出现表达量增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达出现下降。而在12h处理组中，上述蛋白并未出现明显变化。Western blot结果进一步证实HCPT引发的细胞凋亡是跟随细胞自噬发生后出现的。见图5。

图5 HCPT诱导HeLa细胞凋亡相关蛋白变化

3　 讨论

喜树碱是从我国特有的珙垌科植物喜树中分离提取出的五环生物碱。是唯一具有选择性抑制DNA Topo I作用的植物类抗肿瘤药，目前已广泛应用于临床。近来国内外已进行大量的研究发现羟喜树碱作用稳定且不良反应小，可有效诱导多种肿瘤细胞和部分非肿瘤细胞的凋亡［5］。宫颈癌是危害女性健康的第二大常见肿瘤，每年约造成30多万人死亡，并出现明显的年轻化趋势，严重威胁广大女性的健康。目前主要的治疗手段仍是放疗和化疗相结合的综合治疗［6］。

本资料通过western blot和GFP-LC3 shRNA转染细胞等检测方法，首次发现HCPT作用于HeLa细胞后能够引发自噬，并且随着作用时间的延长，其自噬水平成增强趋势。本实验所选取的自噬指标蛋白中，微管相关蛋白1轻链3（LC 3）是目前研究较多的自噬标志性物质，其定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，参与自噬体的形成，被认为是自噬特异性形成指标［7，8］；而另一种蛋白Beclin-1是哺乳动物的自噬调控基因，是自噬发生的触发器，其表达的上调可诱导自噬的形成，两种自噬指示蛋白在HCPT的作用下，均出现表达量增加。一些研究发现，在宫颈癌的发生发展中，自噬相关蛋白的表达被抑制，从而下调了自噬的形成，造成肿瘤的不断生长，另外，也有研究发现，当自噬相关蛋白过表达后，宫颈癌细胞的生长会受到明显抑制［7，8］，因此，通过诱导自噬形成有可能成为未来宫颈癌治疗的策略之一，而本实验所选取的HCPT这种药物就是通过诱导自噬的形成来达到抗肿瘤的目的。

同时，除能够增加细胞的自噬外，作者通过weatern blot以及Hoechst染色也证实HCPT还可以引起细胞凋亡，并且凋亡现象出现在自噬发生之后，表明HCPT作用于细胞后，首先引起细胞自噬水平的升高，进而触发细胞凋亡信号的启动，最终导致肿瘤细胞凋亡，达到抗肿瘤的目的。

研究认为，自噬与凋亡的机制之间关系密切，存在着许多重叠的部分。一些观点则认为自噬是凋亡必需的，当自噬受到抑制时会延缓凋亡的发生，而自噬水平的升高常导致细胞凋亡通路的激活。本资料证实，在宫颈癌细胞中，HCPT的抗肿瘤的机制是首先通过激活细胞自噬，进而触发细胞凋亡，从而达到其抗肿瘤的目的，也提出自噬和凋亡之间有着密不可分的关系。同样，其他类似的研究也发现，顺铂作用HeLa细胞后，自噬小体形成数增加，自噬蛋白Beclin-1和LC3表达量也增加，同时激活内质网应激通路，表明内质网应激—自噬反应参与了顺铂对宫颈癌细胞的细胞毒性作用［9～11］。

宫颈癌是威胁女性健康的恶性肿瘤，目前，仍无有效的治疗方式。而自噬是维持细胞稳态的重要通路，在疾病中的作用逐步得到认同。本资料表明HCPT在抗宫颈癌发生过程中的机制问题，是通过激活细胞自噬从而抑制宫颈癌细胞的生长，最终导致细胞死亡，为HCPT在治疗宫颈癌方面提供理论基础，也为开发类似药物提供新的思路。

1 李静.Beclin1、Caspase3在宫颈鳞癌患者新辅助化疗前后癌组织中的表达及其意义.郑州大学，2010.

2 张碧蓉，谢丽玲.自噬在宫颈癌发生发展及治疗中的作用.实用预防医学，2013，20（6）：768～769.

3 常靓，霍炳杰，冯莉，等.胃癌组织中miR-200a、miR-200b和miR-429的表达及临床意义.肿瘤防治研究，2013，40（11）：1098～1100.

4 施斌，方超，游美羡，等.聚乙二醇修饰对羟喜树碱隐形纳米囊泡的肿瘤靶向和抑瘤作用的影响.中国临床药学杂志，2006，15（1）：46～49.

5 卫薇，赵栋，张志荣，等.羟喜树碱磷脂复合物理化性质的研究.华西药学杂志，2008，23（4）：396～399.

6 王赞宏，段振玲，李莉.自噬基因Beclin1抑制宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤生长的研究.现代妇产科进展，2011，20（5）：361～364.

7 张碧蓉，谢丽玲.自噬在宫颈癌发生发展及治疗中的作用.实用预防医学，2013，20（6）：768～769.

8 朱兴春，刘青松，杨慧敏，等.末端结合蛋白1（EB1）在宫颈组织中的表达及其对自噬标志蛋白表达的影响.复旦学报（医学版），2014，41（5）：641～646.

9 李晓妍.自噬标记蛋白Beclin1、p62在宫颈癌中的表达及临床意义.安徽医科大学，2014.

10 文静.羟喜树碱对人肾上腺皮质癌SW-13裸鼠移植瘤生长及其DKK-1和β-catenin基因转录的影响.广西医科大学，2014.

11 张颂婕.自噬基因ARHI与Beclin1在宫颈癌中的表达及意义.吉林大学，2013.

Objective To explore the antitumor mechanism of Hydroxycamptothecin（HCPT） on cervical cancer. Methods Western blotting and Hoechest staining Methods were used to detect the level of apoptosis and autophagy after HCPT being used on Hela which is cervical cancer cell line. Results After using HCPT，the expression of the regulators of Beclin-1，p62 and microtubule-associated protein 1 light chain 3 （LC3） were upregulated and then the autophagy of Hela cells were triggered. In the meanwhile，the autophagy induced cell apoptosis . Conclusion HCPT can induce Hela cells apoptosis by stength the cells autophagy.

HCPT cervical cancer autophagy apoptosis

湖北省卫生厅（ 2012Z-Y02）；湖北省卫计委一般面上项目（WJ2015MB084）

430060 武汉大学人民医院（程艳香）433000 湖北省仙桃市第三人民医院（陈干涛）
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