补气益精生血法治疗β地中海贫血11例及对BCL11A影响

卢焯明，张春红，杜广亮，陈致雯（广州市中医医院，广东 广州510130）

·临床研究·

补气益精生血法治疗β地中海贫血11例及对BCL11A影响

卢焯明，张春红，杜广亮，陈致雯
（广州市中医医院，广东 广州510130）

目的观察补气益精生血方药对中间型β地中海贫血（β地贫）患儿疗效及对关键红系反式作用因子的影响。方法采用随机对照双盲双模法将入选的β地贫患儿24例分为中药组11例及对照组10例，中药组口服黄芪、党参、龟板、当归颗粒及安慰剂片，对照组口服羟基脲片及安慰剂颗粒，疗程12周。观察2组血常规及胎儿血红蛋白（HbF）比例等指标，并以实时荧光定量PCR反应检测BCL11A基因的转录表达水平。结果治疗后中药组血红蛋白值为（8.90±1.57）g/dL，对照组为（9.06±1.73）g/dL，2组比较无显著性差异（P＞0.05），但2组治疗后HbF均较治疗前有显著提升（P均＜0.01）。中药组能显著下调BCL11A基因表达水平，由治疗前（0.34± 0.11）copies下降至（0.18±0.13）copies（P＜0.05），下调程度亦优于对照组（P＜0.01）。结论补气益精生血法治疗小儿β地贫具有较好疗效，其分子机制可能与抑制BCL11A从而诱导胎儿血红蛋白生成有关。

β地中海贫血；胎儿血红蛋白；BCL11A；中医药疗法

地中海贫血（下称地贫）是在我国南方常见的严重危害儿童青少年健康的一种遗传性溶血性贫血疾病，很多患儿需要依赖输血及长期去铁治疗。但两种治疗手段存在着内皮损伤、传染病暴露等毒副作用，也给患儿家庭带来了较大的经济负担［1-2］。至于治疗重型地贫的骨髓移植，由于骨髓来源少、费用高昂等因素只有少部分病人能惠及［3］。β地贫另一可选的治疗手段为珠蛋白基因诱导，即通过药物来诱导γ珠蛋白基因高表达以合成胎儿血红蛋白（fetal hemoglobin，HbF），在代偿正常血红蛋白不足的同时也可以结合β地贫患儿血中过多的α链从而减轻溶血［4-5］。以羟基脲为代表的各种诱导西药有一定疗效，但其骨髓抑制、免疫抑制及潜在可能致癌等毒副作用，使它们的临床应用受到限制［6］。传统中医药相对毒副作用较小，本课题组既往的地贫中医证候规律研究［7-8］总结出β地贫的核心治法——补气益精生血，同时我们通过体外实验又筛选出补气益精生血的中药龟板、黄芪、党参等能诱导人类红系细胞株表达γ珠蛋白基因并合成HbF［9-11］。后续临床研究进一步证明了补气益精生血中药的良好疗效［12-13］，但具体分子机制有待继续深入探讨。反式作用因子B细胞淋巴瘤11A蛋白（B cell lymphoma 11A，BCL11A）新近发现是影响到β及γ珠蛋白基因表达最关键的红系反式作用因子之一［14］。本研究运用龟板、黄芪、党参加当归的补气益精生血改良配方治疗β地贫患儿，检测血液学指标以观察疗效，并与羟基脲片治疗进行随机双盲对照，同时对用药后体内BCL11A基因的表达情况进行分析，从BCL11A基因角度探讨中药起效的分子机制。

1对象与方法

1.1一般资料本研究得到我院医学伦理委员会批准，共纳入了2015年6月—2016年1月在广州市中医医院就诊的中间型β地贫患儿24例，均得到本人或监护人的知情同意。对符合以下标准的β地贫患儿使用SPSS13.0软件随机数字生成器按1∶1的比例完全随机分配进入中药组及对照组各12例（研究过程中药组脱落1例，对照组脱落2例）。2组年龄、性别、病程比较，差异无显著性（P＞0.05），具有可比性，见表1。

表1　2组一般资料比较（±s）

表1　2组一般资料比较（±s）

组别中药组对照组n 12 12 男65 女67年龄/岁6.59±4.30 7.12±3.88

1.2诊断标准根据《血液病诊断及疗效标准》［15］中间型β地贫诊断标准，① 临床表现：多在2～5岁时出现贫血，症状和体征较重型轻，可有地中海贫血面容。② 实验室检查：血红蛋白60～100 g/L （6～10 g/dL），成熟红细胞形态与重型相似，网织红细胞增多，可见有核红细胞，HbF＞3.5%。③ 遗传学：父母均为β珠蛋白生成障碍性贫血。符合上述条件者可作出临床诊断，进一步诊断需进行基因分析。

1.3中医辨证标准根据笔者课题组既往的β地贫中医证候规律研究［7-8］，并参照《中医证候鉴别诊断学》［16］及《中药新药临床研究指导原则》［17］相关内容，制定如下辨证标准。气血不足的四诊症状：①面色淡白或萎黄；② 唇甲色淡；③ 神疲乏力；④ 易受外感；⑤ 自汗；⑥ 脉细弱。肾精亏虚的四诊症状：① 发育落后；② 筋骨痿弱；③ 头晕目眩；④ 易口干；⑤ 少苔；⑥脉沉细。辨证由课题组2名中医师通过四诊来共同判别，凡符合气血不足及肾精亏虚四诊症状各3条或以上，即辨证为气血不足、肾精亏虚证。

1.4纳入标准①年龄2～18岁；②基因分析已确诊为β地中海贫血，符合以上诊断标准及中医辨证标准；③ 血红蛋白（hemoglobin，Hb）≥60 g/L。

1.5排除标准① 有心、肝、肾、内分泌等系统疾患及其他原发性血液病者；② 近12周内曾输血或服用任何抗贫血药物；③ 过敏体质者；④ 有精神疾病不合作或依从性差者。

1.6治疗方法为克服研究者的主观偏倚、参与研究的患者心理因素干扰及中西药剂型的差异，研究采用双盲双模拟法。中药组口服中药配方颗粒（广东一方制药有限公司），包括黄芪颗粒、党参颗粒、龟甲颗粒、当归颗粒，每袋均为饮片10 g的水提取物。用法与用量：2～6岁各1袋，6～12岁各2袋，12～18岁各3袋；均每日1次，混合后以温开水冲服。同时加用西药安慰剂，依据安慰剂制备规范采用糊精制备，外观性状与羟基脲片相似，用法同对照组。

对照组口服羟基脲片（齐鲁制药有限公司），按10 mg/（kg/d）用量，每周连用4 d，停药3 d。同时加用中药安慰剂，中药安慰剂用糊精制备，外观性状与中药配方颗粒相似，用法用量参照中药组。2组疗程均为12周，由掌握随机分组的第三方专人发药。治疗期间不输血或使用其他影响血液系统的药物。

1.7观察指标

1.7.1血液学指标治疗前及治疗后每4周直至12周，分别取患儿末梢血以全自动血细胞分析仪检测血常规，观察血红蛋白（Hb）、红细胞总数（RBC）、红细胞平均体积（MCV）、平均血红蛋白含量（MCH）；治疗前及治疗12周后分别取患儿静脉血以手工计算网织红细胞计数（Ret）；采用碱性血红蛋白电泳法检测HbF比例；采用比色法检测红细胞渗透脆性。

1.7.2安全性指标同上检测血常规方法，观察白细胞总数（WBC）、中性粒细胞总数（NEU）、血小板总数（PLT）；治疗前及治疗12周后分别取患儿静脉血以全自动生化分析仪进行肝功能测定，观察血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、谷氨酸酰基转移酶（GGT））以及肾功能测定包括血清尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）。

1.7.3BCL11A基因表达水平以实时荧光定量PCR检测BCL11A基因的转录表达水平：治疗开始前及治疗12周后分别取患儿静脉血，采用不连续密度梯度离心法分离包含有核红细胞在内的单个核细胞。根据BCL11A基因序列设计并合成引物，用Trizol提取总RNA。使用M-MLV逆转录酶进行逆转录反应，之后使用荧光染料法进行实时荧光定量PCR反应。根据标准曲线、各样本BCL11A基因的Ct值并以内参照基因矫正，得出目的基因mRNA水平相对的拷贝数。每样本的PCR实验使用复孔3次，取均值。

1.8统计学处理数据录入SPSS 13.0软件进行统计，计量资料属正态分布以±s表示，同组治疗前后差异采用重复测量数据方差分析及配对t检验，组间差异采用成组t检验及协方差分析。

2结果

2.12组血常规指标变化比较见表2。

表2　2组血常规指标变化比较（±s）

表2　2组血常规指标变化比较（±s）

注：与治疗前比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01。

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2.22组HbF比例、Ret及红细胞渗透脆性变化比较见表3。

2.32组治疗前后WBC、NEU、PLT变化比较见表4。

2.42组BCL11A基因表达水平变化比较见表5。

2.52组治疗前后肝肾功能变化情况2组ALT、AST、GGT、BUN及Cr的组间差异及治疗前后的差异均无显著性（P＞0.05）。

表3　2组HbF比例、Ret及红细胞渗透脆性变化比较（±s）

表3　2组HbF比例、Ret及红细胞渗透脆性变化比较（±s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与治疗前比较，2）P＜0.01。

组别中药组n 11对照组治疗前治疗后治疗前治疗后10 HbF比例/% 61.15±23.81 72.54±24.832）63.08±30.65 76.50±33.122）Ret 0.032±0.013 0.037±0.0121）0.036±0.017 0.019±0.0132）红细胞渗透脆性/% 62.35±20.10 67.58±18.82 66.45±18.13 73.40±22.63

表4　2组治疗前后WBC、NEU、PLT变化比较（±s）　×109/L

表4　2组治疗前后WBC、NEU、PLT变化比较（±s）　×109/L

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与治疗前比较，2）P＜0.05。

组别中药组n 11对照组治疗前治疗后治疗前治疗后10 WBC 8.35±3.02 8.56±2.111）7.97±2.39 5.30±1.282）NEU 3.18±2.66 3.62±1.201）3.06±2.11 1.93±1.052）PLT 353.00±165.66 348.51±155.81 317.00±156.40 193.50±140.63

表5　2组BCL11A基因表达水平变化比较（±s）copies

表5　2组BCL11A基因表达水平变化比较（±s）copies

注：与对照组比较，1）P＜0.01；与治疗前比较，2）P＜0.05。

组别中药组对照组n 11 10治疗前0.34±0.11 0.31±0.13治疗后0.18±0.131）2）0.33±0.20

3讨论

为了得到更客观可靠的证据，本研究在课题组既往研究［9-13］的基础上改用中药与诱导西药的阳性代表药物羟基脲作对照，进行了双盲双模拟的随机对照研究。地贫患儿的Hb需维持在一定水平才能保证其生长发育，因而一般把Hb作为评价疗效的最主要指标。本研究结果显示中药及羟基脲治疗后均可显著提升Hb水平，提示补气益精生血方药对儿童中间型β地贫是有一定疗效的。但如果是针对羟基脲的优效检验，本研究样本量明显不足，有待今后扩大样本量进一步深入考察。

本研究显示中药也能提升患儿RBC水平，而RBC上升可能是骨髓造血功能的提升，也可能是外周血中红细胞破坏的减少。本研究同时显示中药能一定程度上提升患儿的网织红细胞计数，提示中药有可能刺激了患儿的骨髓造血。至于羟基脲组RBC及网织红细胞计数在治疗后均有下降，可能与羟基脲抑制骨髓的毒副作用有关。另外，中药及羟基脲对患儿的红细胞脆性似乎也有轻度改善作用，但确切效果未明。后续我们运用碱性血红蛋白电泳法检测了HbF水平，结果提示中药及羟基脲均可诱导γ珠蛋白基因表达从而合成HbF，此结果也进一步提示2组Hb水平的提升主要来源于HbF而不是HbA，而2组红细胞脆性的改善也可能与γ珠蛋白基因表达合成γ链再结合α链生成HbF（α2γ2），从而减少了α链四聚体引起的溶血有关。

对于诱导γ珠蛋白基因表达合成HbF的分子机制，本研究从关键红系反式作用因子角度作了进一步分析。反式作用因子BCL11A在沉默γ珠蛋白基因及血红蛋白发育转换中的重要作用是近年国际血液学研究的重大发现之一，相关研究论文相继发表在《Science》、《Nature》等顶级学术期刊上［14，18］。我们运用实时荧光定量PCR检测用药前后BCL11A基因的mRNA水平，结果提示中药可显著抑制BCL11A基因的转录表达，而羟基脲则无明显作用。至于中药对BCL11A基因在翻译表达水平的影响，能否真正减少BCL11A的蛋白含量，有待后续western blot等实验进一步确认。

BCL11A对γ珠蛋白的抑制与它对β-LCR上的HS3、γ珠蛋白基因启动子以及γ-δ基因间区域等作用有关，BCL11A沉默或缺失可使γ珠蛋白基因表达抑制得到解除从而提升HbF［18-21］。某些西药如泊马度胺［22］、细胞因子类药物［23］对γ珠蛋白的诱导即与其抑制BCL11A有关。另有体外研究发现：存在于葡萄皮及红酒中的天然物质白藜芦醇能通过抑制细胞株BCL11A从而诱导γ珠蛋白及HbF［24］。目前尚未见中药对BCL11A影响的研究报道，本研究首次从关键红系反式作用因子BCL11A的前沿角度探讨了中药治疗β地贫的分子机制，具有一定的创新性。

在与其他红系转录因子的关系方面，BCL11A 与 SOX6、Myb、KLF1的共表达及相互作用也是 γ珠蛋白基因沉默的重要机制［19，25，26］。以BCL11A和/ 或KLF1为靶点的反义寡核苷酸基因治疗可有效增加γ珠蛋白的表达［27］。近来研究发现辛伐他汀与抗氧化药物丁基氢醌均能通过同时抑制 KLF1及BCL11A表达从而诱导HbF［28］。作为复方中药其起效机制常常是多靶点、多途径的，今后研究也可着眼于更广泛的多种红系反式作用因子而不一定只局限于BCL11A，同时也可考虑从反式作用因子与顺式作用元件相互作用的角度着手。

在安全性指标方面，羟基脲治疗后患儿的WBC、NEU均显著低于中药治疗的患儿，这可能与羟基脲本身的骨髓抑制作用有关。且羟基脲在一定程度上影响患儿的免疫力，并有潜在致癌的风险性。从目前研究数据看来，补气益精生血中药具有与诱导西药相近的效果，且毒副作用明显较低，具有良好的开发前景。目前研究为初步研究，样本量较少，有待今后扩大样本量以更加明确其疗效及安全性，并从更多途径、更多角度研究其起效机制。

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R556.61

B

1000-338X（2016）02-0001-04

2016-01-20

广东省中医药局科研课题（20141208）；广东省自然科学基金项目（2015A030310311）；广东省科学技术厅-广东省中医药科学院联合科研专项（2011B032200002）。

卢焯明，男，副主任医师，医学博士，主要从事儿科中西医结合临床研究。