独龙江水生丝孢菌资源调查*

王如潇，李 卓，罗宗龙，保旦凤，苏锡钧，苏鸿雁

(1.大理大学基础医学院,云南 大理 671000；2.大理大学农学与生物科学学院,云南 大理 671003)



独龙江水生丝孢菌资源调查*

王如潇1，李 卓2，罗宗龙2，保旦凤2，苏锡钧2，苏鸿雁2

(1.大理大学基础医学院,云南 大理 671000；2.大理大学农学与生物科学学院,云南 大理 671003)

目的：调查独龙江水生丝孢菌资源，了解其多样性特征。方法：从独龙江中段(海拔1285-1692m)采集沉水腐木90份，采用保湿培养法对水生丝孢菌进行培养，基于形态学特征对水生丝孢菌进行鉴定。结果：通过形态学特征比较，共鉴定出水生丝孢菌38属49种。结论：独龙江水生丝孢菌资源丰富，多样性指数为3.56，其中Sporidesmiella(20%)、Ellisembia(8.9%)、Helminthosporium(6.7%)、Minimelanolocus(5.6%)的出现频率相对较高。

独龙江；水生丝孢菌；多样性；沉水腐木

1.前言

水生真菌(Freshwater fungi)是指整个或部分生活史依赖于水环境的真菌[1]。Shearer认为必须依靠水环境才能完成其整个生活史的真菌是水生真菌[2]。水生丝孢菌是水生真菌的主要类群之一，在分类学上属于子囊菌和担子菌的无性型[3]，是一类菌丝体发达，呈絮状或绒状，有丝分裂产孢的真菌[4]。水生丝孢菌可分为三个类群：Ingoldian水生真菌、木生水生真菌和好养水生真菌[5]。

水生真菌是一类珍贵的生物资源，与人类的生活息息相关，是水生生态环境中的重要分解者[6]。它有利于维持水生态的平衡，在自然生态系统中木质素、纤维素的降解、物质循环以及能量转化等方面发挥着重要的作用[7]，而且真菌生长产生的菌丝可以成为水体中动物的食物从而进入生态系统的食物链[8—11]。由于水生丝孢菌对污染物质敏感，且只能生活在洁净的水环境中，所以这种特性可以使其作为环境监测的指示菌[6]。在医药和农药研发等领域也有广泛的应用前景和重要的研究意义[12]。

Ingold最早报道了淡水中的丝孢菌[13]，而且在随后的研究中，Ingold 报道了大量的水生丝孢菌[14—15]。我国对水生真菌的研究开始于20世纪80年代，最初是杨发蓉等在云南滇池、洱海做的一些研究报道[16—17]。直到2000年，云南大学张克勤、蔡磊等人才开始对云南地区水生真菌进行研究[18]。2004年，罗晶等对中国水生真菌进行了系统的研究并对中国发表的水生真菌各类群进行了详细的统计[19]。2011年，陈燕等发表了水生丝孢菌新纪录[20]，2012年胡殿明等报道西双版纳5新种[21]，截止到2013年，中国已经报道水生丝孢菌416种[22]。2015年苏鸿雁等报道大理苍山溪流1新种[23]，刘晓英等报道苍山水生真菌4新种[24]。

滇西北横断山区是中国三大特有物种分化中心之一，其生物多样性保护具有极其特殊的地位和价值[35]。独龙江位于滇西北地区，由于独龙江与金沙江、澜沧江、怒江在横断山区形成由北向南的并流奇观，故有人将它称为三江并流区的“第四江”[26]。独龙江受西南季风及地貌特征的影响，气候温和，降水充沛，年均降雨量为3672.8mm左右[27]，且该区内森林覆盖率高，生物多样性丰富，素有 “物种基因库”之称[28]。独龙江的自然条件独特多样，是一个独特的地理单元[29]，而且独龙江又拥有最完整的原始生态，这种特殊的生态环境和植被环境极有可能孕育了该地区丰富的水生丝孢菌物种多样性。本实验拟采集独龙江中段上、中、下游沉水腐木进行观察，目的是了解该地区水生丝孢菌物种的多样性，为以后的科研提供一定的数据参考，并对独龙江的水生丝孢菌物种多样性进行保护。

2.实验材料与方法

2.1 样品采集

2015年5月，沿独龙江中段(海拔1285m—1692m)岸边，从下游往上游随机采集长期(3个月以上)浸泡在溪水中的沉水腐木。一般选择表皮脱落，指甲掐压时松软的木头，直径1—5cm、长20—30cm的沉水腐木。共采集5个样点，采集样品数为90，放在自封袋内带回实验室，并在袋子上标记采集信息(表1)。

表1 采样点地理信息

2.2 培养基的配制

PDA培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水加至1000mL[30]。

WA培养基：琼脂18g，蒸馏水加至1000mL[30]。

MEA培养基：麦芽浸膏30g，大豆蛋白胨3g，琼脂18g，蒸馏水加至1000mL[31]。

以上培养基经高压蒸汽灭菌(121℃, 20min)后冷却至50℃(以不烫手为宜)时加入终浓度为100μg/mL氨苄青霉素混匀，倒入平板备用。

2.3 保湿培养

将采集的样品装在塑料自封袋后带回实验室，采用保湿培养法进行培养。室温条件下，将已灭菌的吸水纸置于已消毒的保鲜盒底部用无菌水喷湿，然后放置2—4根适量长度的塑料吸管作为支杆以保证样品不与底部接触，将样品放于支杆上，适当盖上盖子，但不密闭，以防止样品发霉，将保鲜盒放于无阳光直射的地方室温培养即可。培养一周后开始观察，期间根据需要向保鲜盒内实时添加适当无菌水，保持样品的湿润，样品可培养观察1—3个月。

2.4 镜检

在GL-99BI连续变倍体视镜下观察水生丝孢菌子实体的外部形态，并用大头针在相应的地方做好标记，对所观察到的丝孢菌用Nikon-SMZ1000进行外部形态拍照。用接种针将腐木上的菌体挑出，以无菌水、甘油等作为浮载剂，对所观察到的真菌进行制片，将制备好的丝孢真菌玻片置于普通显微镜下进行观察，如果菌株各部分形态特征较好，将该片子置于OLYMPUS BX51生物显微镜下进行微观拍摄。

2.5 拍照及拼图

每个菌种至少拍摄30个分生孢子及5—10个完整的分生孢子梗、产孢结构及其他特征。在拍摄完成后需要详述各部分形态特征，并选取能真实反映菌种典型特征的各个结构图片用Photoshop软件进行拼图，包括菌种的外形、微观下的完整形态、产孢结构、分生孢子、萌发的分生孢子和纯培养等。

2.6 菌种的分离纯化

在GL-99BI连续变倍体式镜下锁定目标菌株，用无菌牙签将分生孢子挑取下来，转移到PDA或WA平板上，保证每皿至少有5—7个分生孢子。室温培养，24h后进行观察，将萌发的分生孢子转接到PDA培养基或MEA培养基上，用保鲜膜封口，室温培养，另挑取萌发的孢子制片，用OLYMPUS BX51显微镜拍照，以上操作均在无菌条件下进行，定期检查菌落的生长情况，若发现污染需要及时转接纯化。

2.7 菌株鉴定

根据相关文献[31—36]，通过比较分生孢子梗、产孢细胞的形态特征以及分生孢子的形成方式、形状大小、颜色、分隔、有无附属物等特征将其鉴定到属、种。

2.8 菌种的保存

MEA斜面试管保存：将目的菌株移置于MEA试管斜面上，适温下培养至菌体充分生长(至少两周)，然后存放于4°C清洁冰箱中，整个过程需无菌操作。该方法需要每隔3—6个月移植1次，而且培养基容易干燥，菌体活力散失快，因此该方法只适合短期保存。

无菌水离心管保存：将目的菌株置于盛有无菌水的离心管中，密封后存于4°C清洁冰箱中，每一种菌均分装于3—5个离心管中，整个过程需无菌操作。该方法适宜长期保存，可使菌种存活多年。

甘油保存：15%甘油，85%蒸馏水，将培养好的菌种置于盛有甘油无菌水的离心管中，密封后存放于4°C清洁冰箱中，每一种菌均分装于3—5个离心管，整个过程需无菌操作，该方法一般每隔1年转接一次，可保存2—3年。

2.9 干标本制作

在GL-99BI连续变倍体式镜下锁定真菌子实体，用大头针在相应的地方做好标记，再用小刀将生长有真菌子实体的小块木片(约3×3厘米大小)切割下来。将切割下来的小块木片用胶水粘贴在一张12×8厘米大小的白纸上，放在空气中风干，并对其编号。风干后的干标本放入信封中，放一个樟脑丸，长期保藏。

2.10 数据分析

水生丝孢菌出现频率(%)=(某个种出现次数/样品总数)×100%

采用香农-威纳指数(H)分析独龙江水生丝孢菌的多样性[37]。Shannon Wiener指数为：

其中H是香农-威纳指数，Ni是某种真菌的数量，N是所有真菌的数量，Pi是某种真菌的数量占所有真菌数量的百分比，S是所有真菌的种数。

3.实验结果

本研究从独龙江中段采集沉水腐木90份，采用保湿培养法对样品进行培养，基于形态学对所获得的所有水生丝孢菌进行鉴定，共鉴定出水生丝孢菌38属49种，其中出现频率相对较高的属为Sporidesmiella(20%)、Ellisembia(8.9%)、Minimelanolocus(6.7%)、Helminthosporium(5.6%)(表2),采用香农-威纳指数计算得出独龙江多样性指数是：3.56。

表2 独龙江已鉴定的水生丝孢菌的属级出现频率

(注：检出率为该物种在所有样品中的出现频率。)

4.讨论

2007年，Shearer等预测淡水中含有大量的水生真菌有待研究发现[38]。独龙江位于滇西北地区，滇西北横断山区是中国三大特有物种分化中心之一，是中国生物多样性的中心[25]。本研究对独龙江中段的90份样品进行检测，通过形态学的方法进行鉴定，共鉴定出水生丝孢菌38属49种，其中Sporidesmiella(20%)、Ellisembia(8.9%)、Minimelanolocus(6.7%)、Helminthosporium(5.6%)，为独龙江常见属，独龙江水生丝孢菌的香农-威纳指数(H)为：3.56，这一结果表明独龙江的水生丝孢菌物种丰富，多样性较高，这与Shearer等的预测一致。

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(责任编辑 徐成东)

InvestigationontheResourcesofFreshwaterHyphomycetesoftheDulongRiver

WANGRuxiao,LIZhuo,LUOZonglong,BAODanfeng,SUXijun&SUHongyan

(College of Basic Medicine, Dali University, Dali, 671000, Yunnan Province; College of Agriculture & Biology Sciences, Dali University, Dali, 671003, Yunnan Province)

Objective:ToinvestigatediversityandresoursesofhyphomycetesinDulongRiver.Method: 90sampleswerecollectedfrommiddleofDulongRiver(Altitude1285m-1692m)inMay2015,usingthemoisturizingincubationmethodtoincubatethefreshwaterhyphomycetesandidentifiedthemunderthemorphologicalcharacters.Results:Underthemorphologicalcharacters,theinvestigationindicatedthatthereare38genera49speciesofhyphomycetes.Conclusion:TherearehighrichnessanddiversityoffreshwaterhyphomycetesinDulongRiver.Theindexofdiversityis3.56.Amongthegenerafoundinthisarea, Sporidesmiella(20%)、 Ellisembia(6.7%)、Helminthosporium(6.7%)、Minimelanolocus(5.6%)appearshighfrequencyrelatively.

DulongRiver;Hyphomycetes;Diversity;submergeddecayedwood

国家基金，项目编号：31460015；云南省中青年学术带头人资助项目，项目编号：2012HB-042。

2016 - 05 - 15

王如潇，女，硕士研究生，研究方向为微生物及疾病。

苏鸿雁(1968—)，女，教授，从事菌物学研究。

Q949.3

A

1671 - 7406(2016)06 - 0026 - 06