元谋巨峰葡萄种子缩合单宁抗氧化性的研究*

张 伦,胡小安,高顺玉,徐成东

(楚雄师范学院化学与生命科学学院，云南 楚雄 675000)



元谋巨峰葡萄种子缩合单宁抗氧化性的研究*

张 伦,胡小安,高顺玉,徐成东

(楚雄师范学院化学与生命科学学院，云南 楚雄 675000)

缩合单宁是最有效的自由基清除剂之一，具有非常强的清除自由基和抗氧化的能力。论文以楚雄元谋地区巨峰葡萄籽为原料，通过单因素试验和正交试验探究了种子中缩合单宁的提取工艺及抗氧化活性。结果表明：缩合单宁提取的最佳条件是料液比为1∶6，乙醇浓度为70%，提取温度50℃，提取时间定为30min，清除DPPH·(二苯基苦基肼)自由基的能力最佳的缩合单宁浓度为120ug/ml，清除率最高为85.98%。

巨峰葡萄；缩合单宁；抗氧化性

葡萄是世界上很受人们欢迎的水果，它的种植面积和产量在水果中都排世界第一位[1]。在葡萄籽众多提取成分里，缩合单宁是葡萄多酚类化合物，由于其拥有天然抗氧化性，并且能防止动脉粥样硬化，具有清除特定自由基、抗凝血、抗癌抗肿瘤、防治糖尿病等多种功效，因而倍受人们的青睐[2—4]。本研究以云南楚雄永仁地区种植的巨峰葡萄籽为实验材料，寻求最佳提取缩合单宁工艺，并对其抗氧化活性进行研究，为楚雄地区巨峰葡萄的种植和应用提供理论依据。

1.材料与方法

1.1材料与仪器

巨峰葡萄采自楚雄元谋葡萄园，葡萄籽50—60℃的恒温箱中烘干，粉碎，过筛(30—60)目，备用；无水乙醇、浓硫酸、香草醛、二苯基苦基肼、儿茶素均为分析纯。

电子分析天平、DFY-500摇摆式高速中药粉碎机、KB5200型超声波清洗器、HH-S2恒温水浴锅、SHZ-A循环水式真空泵、Alpha-1502紫外可见分光光度计(上海谱元仪器有限公司制造)。

1.2提取工艺流程

干燥的葡萄籽粉末→乙醇提取(超声波辅助提取)→抽滤→烘干至恒重(50 ℃)→刮下粉末称重(分析天平)→配成溶液测吸光度

1.3缩合单宁含量的测定

香草醛-硫酸法标准曲线的绘制。以儿茶素为标样，配置1mg/ml的儿茶素/甲醇标准溶液；配成0.1mg/ml、0.2 mg/ml、0.3 mg/ml、0.4 mg/ml、0.5 mg/ml浓度；准确配置3%的香草醛-甲醇溶液与30%的硫酸-甲醇溶液；在反应体系0.5ml标样+2.5mlA3%香草醛+2.5mlB30%硫酸；温度为30℃下避光反应30min，后测其在500nm处的紫外吸收值，空白样为0.5ml的甲醇。

1.4缩合单宁的测定

以香草醛-硫酸法测定缩合单宁的含量，具体实验法案如下：

用甲醇将提取出来的缩合单宁样品配制成0.3mg/ml的待测样品溶液。

空白：0.5 ml甲醇+2.5 ml3%香草醛+2.5 ml 30 %硫酸

样品测定：0.5 ml样品/甲醇+2.5 ml 3 %香草醛+2.5 ml 30 %硫酸,30 ℃避光反应20min后测定 500 nm处的吸光值。

依据实验测定的如下标准曲线(以儿茶素为标准)进行代入法计算缩合单宁含量。

1.5葡萄籽粉末的含水率测定

称取2g葡萄籽粉末包好，放到烘干箱烘12h，取出称质量。计算葡萄子粉末的含水率W。

W=烘干前-烘干后(g)/ 烘干前(g)

1.6缩合单宁抗氧化活性测定

清除二苯基苦基肼自由基(DPPH，2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl)法。DPPH·自由基清除率的测定公式：

IP%=Ac-(Ai -Aa)×100/Ac

其中：Ai—样品对DPPH·作用后的吸光度数值；

Aa—反映样品本身对吸光度的贡献；

Ac—为DPPH·本身在测定波长的吸收。

通过计算IC50来展现出乙醇溶剂提取出的缩合单宁清除DPPH·自由基能力的大小。

IC50的计算试为：

1.7 数据处理

Excel进行数据处理并作图

2.结果与分析

2.1标准曲线

根据方法所绘出的标准曲线如下图1所示：

图1 儿茶素标样吸光度

根据儿茶素/甲醇标样测出吸光度后做出的标准曲线表达式是Y=3.516x+0.117,R2=0.993。我们测出缩合单宁样液的吸光度后，可根据标准曲线方程、提取率的公式计算出缩合单宁的提取率，最后根据提取率的柱状图挑选出最佳提取条件。

2.2葡萄籽含水率测定结果

表1 葡萄籽粉末含水率测定

由上表可以看出葡萄籽中含有的水分很少，烘干前后质量基本无变化。

2.3粉碎粒度对提取率的影响

使用过筛后且粉碎粒度分别是30—60目的葡萄籽原料，在添加量固液比是1∶6，乙醇浓度是60%，温度是40℃，提取时间是30min的条件下，来考察粉碎粒度对缩合单宁提取效果的影响，试验结果如图2所示。

图2 粉碎粒度对缩合单宁提取效果的影响

在试验中，试验原料的表面积越大，即原料越细，得率就越高。如上图2所示，葡萄籽粉碎粒度从30—60目，提取率一直上升，60目筛下的葡萄籽粉末缩合单宁的提取率达到最高。所以后文中的单因素、正交试验及缩合单宁的抗氧化性测定采用粉碎粒度为60目的葡萄籽粉末进行。

2.4超声波辅助提取法的单因素试验

2.4.1.料液比对缩合单宁提取效果的影响

本试验用粉碎粒度为60目下的葡萄籽粉末(以下试验都用60目)，以50%的乙醇作为提取溶剂，超声波内水温是30℃，提取时间是30min，反映出的是不同料液比(1∶5,1∶6,1∶7,1∶8)对缩合单宁提取效果的影响，试验结果如图3所示。

图3 料液比对缩合单宁提取效果的影响

缩合单宁是具有无毒、无过敏、安全性好的特性，缩合单宁在水中微溶，但在乙醇中能溶解得很好，固液比对葡萄种子中缩合单宁的提取效果影响较大，在一定范围内添加乙醇溶剂的用量可提高缩合单宁的得率，但不管什么条件都有一个最适的点，由上图3可知当料液比在1∶6以前时随着提取溶剂的添加量的增大，缩合单宁的得率是呈上升的趋势，料液比为1∶6时缩合单宁的得率达到最大，固液比为1∶6以后，增大固液比，缩合单宁的得率呈现下降趋势。出现这种现象是由于乙醇水溶液的用量达到一定的量后，葡萄籽中含有的缩合单宁已经全部被溶出，再增加乙醇水溶液的用量，不但提取率不会上升，而且提取得率有下降趋势(如上图所示)，还可能导致试验资源的浪费，所以由上图所示超声波辅助提取法的最佳料液比定为1∶6。

2.4.2温度对缩合单宁提取效果的影响

根据固液比的单因素试验，本试验将固液比定为1∶6(g/ml)、乙醇的体积分数为50%，提取时间为30min的条件下，反映出的是不同超声波水温(30—60℃)对缩合单宁提取效果的影响，试验结果如图4所示。

图4 温度对缩合单宁提取效果的影响

由图4可知，温度在40℃以下时，跟随试验中控温的升高缩合单宁的得率也不断增大。超声波水温在40℃以后，跟随超声波水温的加大，缩合单宁的得率反而减小了，从上图看出缩合单宁的最佳温度是40℃。上图反应出提取温度对缩合单宁的得率有一定的影响，超声的热效应及空化作用会使局部产生高压高温，低温不利于缩合单宁的提取，高温则会加剧缩合单宁的分解，影响缩合单宁的提取率，因此在缩合单宁的最佳提取温度40℃以后，跟随超声波水温度的增加缩合单宁的得率减小了。

2.4.3乙醇浓度对缩合单宁提取效果的影响

根据以上固液比、温度为变量所做试验，本试验在固液比为1∶6(g/ml)，超声波水温是40℃，时间是30min的条件下，考察了以下几个乙醇体积分数(50—80%)对缩合单宁提取效果的影响，实验结果如图5所示。

图5 乙醇浓度对缩合单宁提取效果的影响

从上图5可以看出，乙醇水溶液浓度在60%以前，跟随乙醇水溶液浓度的升高，缩合单宁的得率有一个上升的趋势，而乙醇水溶液的浓度在60%之后，跟随乙醇水溶液浓度的加大，缩合单宁的提取得率在不断减小。原因是缩合单宁是属于极性物质，在提取的过程中，乙醇浓度的改变会使提取溶剂的极性受影响而有所变化，进而会使缩合单宁的溶解度和选择性也受到影响，试验中根据相似相容的原理来调节乙醇和水的配比，从而使乙醇溶剂的极性有所改变，对缩合单宁的得率有较大的影响。在合适乙醇溶剂浓度下，应该可以在得到比较大的缩合单宁得率的同时使提取物中蛋白的含有量尽量的少。实验结果表明60%的乙醇溶液对葡萄籽中含有的缩合单宁的提取效果是最好的。所以缩合单宁最佳提取的乙醇水溶液的浓度是60%。

2.5正交设计优化提取条件

2.5.1正交试验

在以上单因素的基础上，选取超声提取温度、乙醇浓度、料液比作为因素变量，主要用缩合单宁的得率作为衡量尺度，采用L9(33)的正交表进行正交优化试验[5]，因素水平如表2所示。

表2 试验因素水平L9(33)表

表3 正交试验结果和极差分析

由上表结果表明，超声温度、乙醇浓度、料液比三个变量因素对缩合单宁得率的影响的大小排序为：料液比(C)>乙醇浓度(B)>提取温度(A)，并且由正交试验得出缩合单宁超声波获取的最优工艺条件是:A3B3C2,即50℃、70%、1∶6。

综合单因素和正交试验的结果，可以得出用超声波辅助浸提法来获取巨峰籽中缩合单宁最合适的工艺条件为：提取温度为50℃、乙醇体积分数为70%、固液比为1∶6(g/ml)、提取时间为30min。

2.6缩合单宁的抗氧化性测定

表5 不同缩合单宁浓度下的IP%和IC50

续上表

样液浓度(ug/ml)708090100110120140160180200样+DPPH的吸光度0069005500480047003900360048004200420041Aa0003000200020002-0002-00010002000200030002Ai0070005600490048004000370049004300430042IP%7528800782668303845085988266848785248524IC50(ug)282246219197179164141123110099

2.6.1缩合单宁浓度对自由基清除率的影响

缩合单宁具有很强的自由基清除能力，将粉碎粒度为60目的葡萄籽粉末，用最佳条件(1∶6，70%，50℃)提取出的缩合单宁做抗氧化测定，结果如图6所示。

图6 缩合单宁浓度对自由基清除率的影响

由图6可以看出葡萄籽中缩合单宁具有较强的清除DPPH·自由基的能力，在缩合单宁含量为5-120ug/ml时，跟随缩合单宁样液浓度的逐渐升高，清除DPPH·自由基的能力也跟随逐渐加强。当缩合单宁的样液浓度高于120ug/ml时，随着缩合单宁样液浓度的逐渐增大，清除DPPH·自由基的能力逐渐减小且趋于平稳，所以清除DPPH·自由基的能力最佳的缩合单宁样液浓度是120ug/ml，清除率最高可达85.98%。

2.6.2缩合单宁浓度对IC50的影响

通过计算IC50来评价乙醇溶剂提取缩合单宁清除DPPH·自由基能力的大小。

图7 缩合单宁浓度对IC50(μg)的影响

由图7可以看出在最佳条件下提取出的缩合单宁的清除DPPH·自由基能力，上图反映出缩合单宁样液浓度为5-10ug/ml的时候，缩合单宁清除DPPH·自由基的能力急剧变化；缩合单宁样液浓度为10-80ug/ml的时候，缩合单宁清除DPPH·自由基的能力变化较缓慢；缩合单宁样液浓度为80-200ug/ml的时候，缩合单宁清除DPPH·自由基的能力变化逐渐稳定。

3.结论

以巨峰葡萄籽为原料来提取其浓缩单宁、探究了浸取温度、料液比、乙醇浓度对橄榄树皮中原花色素提取率的影响，并利用正交实验得出最佳提取工业条件，实验结果表明，各因素对原花色素的提取率的影响次序为：超声温度、乙醇浓度、料液比三个变量因素对缩合单宁得率的影响的大小排序为：料液比(C)>乙醇浓度(B)>提取温度(A)，并且由正交试验得出缩合单宁超声波获取的最优工艺条件是: 温度为50℃、乙醇浓度为70%、料液比为1:6 mg/mL，在该条件下原花色素的提取率可达4.6%。此外，巨峰葡萄籽中缩合单宁具有较强的清除DPPH·自由基的能力，随着缩合单宁样液浓度的逐渐增大，清除DPPH·自由基的能力逐渐减小且趋于平稳，当缩合单宁样液浓度为120ug/ml，清除率最高可达85.98%。

[1]时国庆.葡萄籽中原花色素的提取,分离与抗氧化性研究[D].郑州:郑州大学硕士学位论文,2004,5(01): 1—58.

[2] Sivakumaran S,Molan A.L, Meagher L.P.etal.Variation in antimicro—bial action of proanthocyanidins from Dorycnium rectumagainst rumen bacteria[J].Phytochemistry, 2004, 65 (17):2485—2497.

[3] Nergro C, Tommasi L, Miceli A. Phenolic compounds and antioxidant activity from red grape mare extracts[J].BioresourceTechnology, 2003,87(01):41—44.

[4]唐传核,彭志英.葡萄多酚类化合物以及生理功能[J].中外葡萄与葡萄酒,2000,2(04):12—15.

[5]汪荣鑫.数理统计[M].西安:西安交通大学出版社,2000.

(责任编辑 徐成东)

A Study on Condensed Tannins Antioxidant Activity of Meiguixiang Grape Seed

ZHANG Lun, HU Xiaoan, GAO Shunyu & XU Chengdong

(SchoolofChemistryandLifeScience,ChuxiongNormalUniversity,Chuxiong, 675000,YunnanProvince)

Condensed tannins are one of the most effective free radical scavenger; which have very strong ability of scavenging free radical and antioxidant. Taking the Kyoho-grape seed from Yuanmou district in Chuxiong as the raw material, the extraction technology and antioxidant activities of the condensed tannins have been studied by single factor and orthogonal experiments. The results show that the best extraction conditions of condensed tannin extract is 1:6, ethanol concentration is 70%, extraction temperature 50℃, extraction time is 30min. The condensed tannin concentration of the best scavenging rate of the free radical (DPPH，2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl) was 120ug/ml; the scavenging rate was 85.98%.

Kyoho-grope; condensed tannins; antioxidant activity

云南省应用基础研究青年项目，项目编号：2014FD052；楚雄师范学院学术骨干资助，项目编号：13XJGG03。

2016 - 05 - 16

张 伦(1978—)，女，博士，讲师，从事天然产物化学工作。

徐成东(1964—)，男，博士，教授，从事植物学与植物生态学研究。

S663.1

A

1671 - 7406(2016)06 - 0032 - 07