补肾强督方对强直性脊柱炎膜内成骨Wnt/β-catenin通路影响的实验研究

徐愿 孔维萍 陶庆文 杨文雪 金玥 阎小萍

中日友好医院中医风湿病科，免疫炎性疾病北京市重点实验室，北京 100029

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种慢性炎性疾病，主要侵犯骶髂关节、脊柱骨突、脊柱旁软组织及外周关节，并可伴发关节外表现[1]。多数AS患者在疾病后期继发韧带、纤维环、关节软骨、关节囊的病理性成骨，使脊柱逐渐失去柔软度，造成脊柱强直和关节畸形。在AS中表现为附着点和滑膜关节、软骨结合处形成新骨[2]。这种结构损伤很难逆转，往往导致AS患者脊柱活动受限及关节功能降低，轻者出现下蹲、弯腰、转头等受限，重者行动困难，晚期出现关节屈曲挛缩、畸形或强直，严重影响患者的关节功能和生活质量，给家庭和社会造成沉重的负担[3]。目前普遍认为，AS的病理性成骨主要通过两种方式：软骨内成骨和膜内成骨。①软骨内成骨的过程为骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)通过聚集和分化形成软骨细胞，经过增生、成熟、分化和凋亡，最后形成骨组织。研究表明软骨内成骨是AS骨赘生成的主要形式[4]。②膜内成骨则是BMSCs直接分化为成骨细胞。膜内成骨可能与AS脊柱纵韧带钙化有关[4]。Wnt/β-catenin通路是调节这两种成骨过程的最重要的分子机制，本研究观察补肾强督方对BMSCs 的Wnt/β-catenin通路的作用，为中医治疗AS提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 细胞分化培养

人BMSCs(购自Sciencell，货号：7500)分为空白对照组、西药对照组、补肾强督方低、中、高剂量组。各组细胞分别于MSCM (含 100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素、5%胎牛血清)中进行培养。将人骨髓间充质干细胞分别按照1×105/孔的密度接种于100 mm平皿中，每皿加入不同组全培养基6 mL；按1万/孔的密度接种于24孔板中，每孔加入不同组全培养基2 mL；按1千/孔的密度接种于96孔板中，每孔加入不同组全培养基200 μL。将各培养皿和培养板置于37℃，5% CO2的培养箱中培养3 d，使细胞贴壁，扩增至90%左右，吸弃各培养皿和培养板中的培养基，换为MDOM(间充质干细胞成骨分化培养基) ( 含大鼠含药血清 20%)，置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养21 d。

1.2 药物补肾强督方

组成：熟地20 g，金狗脊30 g，鹿角6 g，骨碎补15 g，补骨脂10 g，桂枝12 g，赤芍12 g，白芍12 g，知母15 g，秦艽15 g，羌活12 g等。中日友好医院药剂室煎制，药物水煎、过滤、浓缩至含生药2.5×103g/L。以洛索洛芬钠为对照药物(上海三共制药有限公司，国药批字：H20030769)。

1.3 大鼠含药血清制备

实验动物选用Wistar雄性大鼠进行灌胃给药，连续给药7 d，末次给药两次，间隔1 h，末次给药前12 h，禁食不禁水，末次给药后1 h大鼠称重，平均220 g/只，10%水合氯醛(中日医院提供)麻醉，每只1.2 mL，剖腹，腹主动脉取血，离心，吸取血清，-20℃保存。药物以补肾强督方为治疗药物，以洛索洛芬钠为对照药物，分组为空白对照组、西药对照组(予洛索洛芬钠3 mg/(kg·d)、补肾强督方低、中、高剂量组[分别予补肾强督方0.9、1.8、3.6 g/(kg·d)]。使用前灭活(56℃,30 min)，过滤(0.22 μm)。

1.4 检测指标及方法

1.4.1试剂及仪器：MSCM(间充质干细胞培养基)、MODM(间充质干细胞成骨分化培养基)、胎牛血清、MTT试剂盒( Sciencell，美国)；茜素红S染色试剂盒(Ared，美国)；Elisa试剂盒( R&D，美国)；RIPA裂解液(凯基生物，中国)；Trizol(Invitrogen，美国)；cDNA转录试剂盒(Roche，瑞士)；引物合成(Invitrogen，美国)；Power SYBR Green PCR Master Mix(Biosystems，美国)。细胞培养箱(Thermo Scientific，美国)；超净台(Airtech，美国)；台式大容量高速离心机(Eppendorf，德国)；超微量高精度紫外分光光度计 ( ND-1000，美国)；多功能酶标仪SpectraMax M2(Molecular Devices，美国)；DNA Engine Dyad PCR 仪(Bio-Rad，美国)；7500荧光定量PCR仪(Biosystems，美国)；倒置显微镜(Olympus，日本)。

1.4.2ELISA方法检测ALP、BGP蛋白含量：BMSCs培养21d后取细胞培养上清液，按照ALP、BGP的ELISA试剂盒说明书操作，450 nm光波处测吸光值，540 mm光波处校正。

1.4.3免疫印迹法分析BMSCs中DKK-1、β-catenin蛋白含量：BMSCs诱导分化21 d后用RIPA法提取蛋白质，BCA法测定蛋白浓度，蛋白质免疫印迹(Western blot，WB)检测细胞中的目标蛋白质含量。样品加入上样缓冲液后100℃加热3 min。每孔上样20 μL总蛋白进行SDS-PAGE。电泳后半干转蛋白至裁剪好的电转膜上，所用滤纸(Whatman,3MM CHR)，电转完毕后，将电转膜置于5%的脱脂奶粉封闭，37℃2 h，加一抗β-catenin(Abcam,货号：ab32572，兔单克隆抗体IgG)和DKK1(Abcam,货号：ab109416，兔单克隆抗体IgG)，均为1∶1000稀释。4℃孵育过夜后加二抗(KPL，货号：074-1516)，室温孵育2 h，ECL发光试剂盒显影，以β-actin为内对照，拍照，对杂交带进行密度扫描分析，比较蛋白的相对表达。

1.4.4荧光定量PCR测定BMSCs膜内成骨中DKK-1mRNA和β-cateninmRNA表达：Trizol提取成骨细胞总RNA。取1μg总RNA，用逆转录试剂盒合成cDNA，再取1 μg cDNA 行荧光定量PCR反应。DKK1 mRNA上游引物为：5′- TCACACCAAAGGAC AAGAAG-3′，下游：5′-ATCTTGGACCAGAAGTGT CTAGC-3′，β-catenin mRNA上游引物为：5′-ACAAACTGTTTTGAAAATCCA-3′，下游：5′-CGAGT CATTGCATACTGTCC-3′。引物均由Invitrogen公司合成，以cDNA为模板按Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒说明书配制20 μL的PCR反应体系，按以下条件进行扩增：步骤1，预变性，1 cycle，95℃，2 min；步骤2，热循环，40 cycle，95℃，15 s，60℃，1 min；步骤3，溶解曲线。每种样品做3个复孔，计算时取平均值。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 各组BMSCs成骨分化ALP、BGP的比较(见表1)

图1 补肾强督方对BMSCs成骨分化中DKK-1及β-catenin蛋白量的影响Fig.1 The effect of Bushen Qiangdu recipe on the protein levels of DKK-1 and β-catenin in BMSCs groups after osteoblast differentiationWestern blot检测BMSCs成骨分化中产生DKK-1及β-catenin相对蛋白浓度，以均数±标准差表示。A: DKK-1 Western blot 电泳图；B：DKK-1 蛋白表达结果分析直方图 Western blot 电泳图；D：β-catenin蛋白表达结果分析直方图与空白对照组比较，*P<0.05，** P<0.01，与西药对照组比较，△P<0.05，与中药低剂量组比较，#P<0.05

各组细胞上清液ALP及BGP采用ELISA检测，结果显示，各组间比较无统计学差异(P>0.05)。

2.2 各组BMSCs成骨分化中DKK1、β-catenin蛋白比较(见图1)

各组细胞DKK1采用Western blot检测，结果显示：与空白对照组比较，中药高剂量DKK1蛋白质产生量显著增高(P<0.01)，与中药低剂量组及西药对照组比较，中药高剂量DKK1蛋白质产生量显著增高(P<0.05)。其他各组件比较无差异(P>0.05)。

表1 各组BMSCs成骨分化后ALP、BGP比较Table 1 Comparison of ALP and BGP between each BMSCs group after osteoblast

各组细胞β-catenin采用Western blot检测，结果显示：与空白对照组及西药对照组比较，中药高剂量β-catenin蛋白质产生量显著降低(P<0.05)；其他各组件比较无差异(P>0.05)。

2.3 各组BMSCs成骨分化DKK1 mRNA及β-catenin mRNA表达的比较(见图2)

各组细胞DKK1 mRNA表达结果显示：与空白对照组比较，中药高中低剂量组DKK1 mRNA表达水平显著增高(P<0.05)；与西药对照组比较，中药中高剂量组DKK1 mRNA表达水平显著增高(P<0.05)；与中药中低剂量组比较，中药高剂量组DKK1 mRNA表达水平显著增高(P<0.05)；其他各组件比较无差异(P>0.05)。

图2 补肾强督方对BMSCs成骨分化中DKK-1mRNA及β-cateninmRNA表达的影响Fig.2 The effect of Bushen Qiangdu recipe on the mRNA levels of DKK-1 and β-catenin in BMSCs groups after osteoblast differentiation荧光定量PCR检测BMSCs成骨分化中产生DKK-1 mRNA及β-cateninmRNA 表达，以均数±标准差表示。A:DKK-1 mRNA表达结果分析直方图表达结果分析直方图与空白对照组比较，*P<0.05；与西药对照组比较，△P<0.05；与中药低剂量比较，#P<0.05；与中药中剂量比较，P<0.05

各组细胞β-catenin mRNA表达结果显示：与空白对照组比较，中药高中低剂量组β-catenin mRNA达水平显著降低(P<0.05)；与西药对照组比较，中药高中剂量组β-catenin mRNA表达水平显著降低(P<0.05)；与中药低剂量组比较，中药高中剂量组β-catenin mRNA表达水平显著降低(P<0.05)；与中药中剂量组比较，中药高剂量组β-catenin mRNA表达水平显著降低(P<0.05)；其他各组件比较无差异(P>0.05)。

3 讨论

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)在疾病进展过程中可同时存在骨丢失和骨形成两个看似矛盾的结果。AS骨丢失表现为骨质破坏及骨质疏松，本病基本都累及骶髂关节，表现为侵蚀性改变；24%～36%患者出现髋关节骨破坏，严重者导致髋关节强直、甚至致残[5]；19%～62%患者出现骨质疏松，甚至在疾病早期即可出现，显著增高脊柱骨折、特别是脊柱压缩骨折的风险[6]。AS骨形成，亦即病理性成骨，多发生在附着点部位，特别是脊柱部位多发，22%～24%患者出现较明显骨化进展，50%～60%无明显骨化进展[7,8]，骨化导致的脊柱强直在病程后期是导致患者痛苦的主要原因，明显影响脊柱活动度，部分长病程患者甚至因功能障碍而致残[9,10]。

骨化研究是AS目前研究的热点，但是进展缓慢，其原因有二：其一，骨化往往发生脊柱附着点部位，病理组织非常难以获取，病理学研究大部分是20世纪基于尸体解剖获得[11]，而现代影像技术如MRI能很好发现炎症改变，但对骨化病变不敏感；其二，骨化进程非常缓慢，且个体间差异大，研究周期往往需要5～10年[7,8]，甚至更长，给研究造成了很大困难。在AS骨化发生机制方面，目前研究证实Wnt、BMP和Hedgehog信号通路与骨化有关，而Wnt通路是研究最为清晰的通路。最早研究Wnt通路在骨化中的作用是一个巧合，为了研究Wnt通路在炎性关节病相关骨质疏松的作用，采用阻断TNF-α转基因鼠中Wnt通路阻滞剂DKK-1，发现实验动物大量发生骨化[12,13]，从而发现Wnt通路在骨化中的作用。进一步研究逐渐发现，发生韧带骨赘的AS患者血清中Wnt通路抑制因子DKK1和SOST水平显著降低[12,14,15]，目前已经提出用DKK1作为骨化的生物标记物[14]。细胞学研究表明，Wnt通路激活可促进BMSCs的软骨内成骨和膜内成骨，导致骨化发生[16]，Wnt通路激动剂Wnt5a还能促进BMSCs表达非组织特异性碱性磷酸酶，促进其骨化进展[17]。AS患者Wnt通路的异常激活参与了AS骨化的发病，因此，从Wnt通路研究中医改善AS骨化的可能机制具有必要性。

阎小萍教授提出强直性脊柱炎“肾虚督寒”的中医基本病机[18]。肾藏精，主骨生髓，肾气亏虚，感受外邪，骨失淖泽而出现骨损、骨痿，表现为关节破坏以及骨质疏松；督脉行于脊背，通于肾，总督人身诸阳，寒邪侵袭，督脉受邪则阳气开阖不得，寒凝督脉而致筋脉挛急，出现脊背僵硬、僵曲不得伸，表现为脊柱骨化、甚至强直改变。“肾虚督寒”的病机很好地解释了本病骨丢失和骨形成两个相矛盾的表现。基于此，创立了“补肾强督方”，该方由熟地、金狗脊、鹿角、骨碎补、补骨脂、桂枝、赤芍、白芍、知母、秦艽、羌活等组成，诸药共凑补肾祛寒、壮督除湿、活血通脉、强健筋骨之效。补肾强督方治疗AS的疗效已得到诸多研究验证：①缓解炎症，改善症状，治疗3月中医有效率达94.5%[19]，达到ASAS20者占74.3%[20]；②改善骨质疏松，显著提高患者骨密度，调节骨代谢[21]，基于补肾强督方研制的补肾舒脊颗粒改善髋关节功能，延缓髋关节X线进展[22]；③调节骨化相关细胞因子，上调血清中骨化抑制因子DKK-1的水平[23]。通过验证研究，进一步证实了AS“肾虚督寒”基本病机。

本研究是对系列研究的进一步补充，结果提示，补肾强督方能够抑制BMSCs成骨分化中Wnt通路的激活，上调DKK-1水平，而临床研究亦提示该方能上调AS患者血清中DKK-1水平，这些均提示该方可能通过Wnt通路抑制AS骨化过程中BMSCs的膜内成骨过程起到调节作用。BMSCs成骨分化是维持骨量的机制之一，虽然该方对Wnt通路有抑制作用，但是不会导致AS骨丢失，因为该研究还显示，补肾强督方在BMSCs成骨分化作用中，体现成骨能力的ALP和BGP无差异，而且该方能够调节成骨细胞OPG/RANKL系统，促进骨生成，抑制骨吸收，改善骨质疏松症[24]。因此，基于“肾虚督寒”理论创立的补肾强督方对AS具有抑制骨化，同时抑制骨丢失的双向作用。对该病机的进一步研究，对于寻找治疗AS骨化的有效药物具有一定的提示作用。