左归丸、右归丸对去卵巢骨质疏松大鼠神经肽CGRP、SP、VIP、NPY的影响

杨锋 杨利学 李小群 李彦民

陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000

神经系统调控骨的发育、修复的研究日益增多，业已证实神经肽降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)、P 物质(substance P， SP)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide，VIP)、神经肽Y (neuropeptide Y，NPY)与其受体构成神经肽网络介导了神经系统与骨组织间信号的传导，影响着骨的各种代谢变化，但它们与绝经后骨质疏松症(osteoporosis,OP)关系以及补肾中药调控机制的相关研究仍较少。左、右归丸均出自《景岳全书》，是补肾阴和补肾阳的代表方剂。左归丸由六味地黄丸化裁而成，去“三泻”(泽泻，茯苓，丹皮),加入枸杞、龟板胶、牛膝加强滋补肾阴之力；又加入鹿角胶、菟丝子温润之品补阳益阴，阳中求阴。右归丸是将左归丸去掉部分滋阴药龟板胶和牛膝，再增加几种辛温补阳药附子、杜仲、肉桂、当归而成。即张介宾所谓：“善补阴者，必于阳中求阴，则阴得阳升而泉源不竭。善补阳者，必于阴中求阳，则阳得阴助而生化无穷”之义。中医在“肾主骨”理论指导下应用左、右归丸治疗骨质疏松症取得了较好的疗效。本文拟采用去卵巢方法诱导OP，分别观察雌激素缺乏状态下模型OP 大鼠骨组织及骨髓间充质干细胞中神经肽CGRP、SP、VIP、NPY及它们受体的分布与表达变化，并观察左、右归丸对神经肽的干预作用，进一步阐明补肾中药复方的整体调节机理。

1 材料和方法

1.1 材料

选择SPF级SD大鼠60只，雌性8月龄，体重200±20 g,购自西安交通大学动物实验中心(陕动质2013492)。DMEM(L) (Gibco,invitrogen,USA)、胎牛血清(FBS, Gibco, invitrogen, USA)、Total RNA 提取试剂盒(Promega)、RT-PCR Kit (invitrogen, USA)、mRNA引物(华大基因)、胰蛋白酶(Gibco,USA)、CO2孵箱(thermo, USA)

1.2 方法

1.2.1实验动物的分组：动物称重后随机分组，将60 只大鼠随机分为4 组，假手术组，模型组，左归丸组、右归丸组，每组15只。

1.2.2造模方法：模型组采用手术切除双侧卵巢的方法诱导OP 模型，称重，麻醉后固定，术区消毒，取大鼠下腹部正中沿腹白线纵行切口约1 cm，打开腹腔，查找卵巢，结扎后切除两侧卵巢后缝合，假手术组开腹后切除少量脂肪保留卵巢。骨密度检测：造模12 w应用双能X 线骨密度仪检测大鼠的骨密度，3%戊巴比妥钠麻醉，双能X线骨密度仪(美国Hologic公司制造, Discovery ASY-00409型)检测，采用小动物骨密度分析软件分析。测定的部位选择腰椎、股骨近侧干骺端。药物干预12 w后用同样方法测量各组骨密度。

1.2.3给药方法：左归丸组成：熟地黄24 g、山萸肉12 g、枸杞子12 g、菟丝子12 g、鹿角胶12 g、龟甲胶12 g、山药12 g、牛膝9 g。右归丸处方组成：熟地24 g、山萸肉9 g、枸杞子9 g、当归9 g、菟丝子12 g、鹿角胶12 g、山药12 g、杜仲12 g、附子6 g、肉桂6 g。分别加水煎制，并根据“人与动物体表面积折算等效剂量比率表”计算临床等效剂量，左、右归丸组每天两次灌胃给药，每次1 mL，连续灌胃12 w周治疗。模型组和假手术组给予等量的蒸馏水。

1.2.4BMSCs的分离、培养：采用全骨髓培养法取SD大鼠骨髓冲洗液，第2代培养细胞进行流式细胞仪检测，结果显示细胞均一性较好，其中CD34、CD45表达呈阴性,而CD90、CD105表达呈阳性，阳性率分别为93.136%和93.182%,提示培养所得细胞为主要是骨髓间质干细胞(BMSCs)，非造血性细胞。用细胞计数板作有核细胞计数，调整细胞浓度为5 ×104/mL,以备实验之用。

1.2.5骨组织中CGRP、SP、VIP、NPY 表达量的检测：取左侧股骨近端相同部位的骨组织，称重，研磨器液氮中匀浆，ELISA检测CGRP、SP、VIP、NPY的表达量，采用免疫组化法观察骨组织中CGRP、SP、VIP、NPY 肽能神经分布。

1.2.6BMSCs中CGRP、SP、VIP、NPY 受体mRNA 的表达检测：采用realtime 荧光定量RT-PCR检测，骨组织称重，研磨器液氮中匀浆，TRIZOL法提取总RNA；根据GenBank 注册的大鼠基因序列，利用软件Primer Premier 5.0设计CGRP、SP、VIP、NPY的荧光定量PCR 引物；提取的RNA浓度测定；引物的合成；逆转录；定量PCR 实验。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences of the genes

1.3 统计学处理

2 结果

模型组与假手术组比较, 有非常显著性差异, 说明造模成功。左、右归丸组与模型组比较有统计学差异，左归丸与右归丸组比较无统计学差异。说明补肾药左归丸和右归丸可以提高去卵巢大鼠的骨密度，见表2。

ELISA测定各组大鼠骨组织中神经肽CGRP、SP、VIP、NPY结果显示，模型组大鼠神经肽水平明显下降，与假手术组比较有统计学意义。左归丸和右归丸组神经肽水平较模型组显著上升，与模型组比较有统计学意义。左归丸与右归丸组比较无统计学差异。见表3。

表2 各组大鼠骨密度测定结果Table 2 Results of bone mineral density

注：与假手术组比较，▼P<0.001；与模型组比较，*P<0.001；与左归丸组比较，▽P>0.05

表3 各组大鼠神经肽测定结果Table 3 Results of neuropeptides in each

注：与假手术组比较，▼P<0.001；与模型组比较，*P<0.001；与左归丸组比较，▽P>0.05

去卵巢骨质疏松大鼠骨组织中CGRP、SP、VIP、NPY 肽能神经分布明显减少，左、右归丸干预后CGRP、SP、VIP、NPY 肽能神经分布与模型组比较显著增加。见图1、2、3、4。

模型组与假手术组比较, 有非常显著性差异, 说明去卵巢模型大鼠神经肽水平显著下调。左、右归丸组与模型组比较有统计学差异，左归丸与右归丸组比较无统计学差异。说明补肾药左归丸和右归丸可以上调去卵巢大鼠的神经肽基因表达水平。见表4。

表4 BMSCs中CGRP、SP、VIP、NPY mRNA 的表达Table 4 mRNA expression of CGRP, SP, VIP, and NPY in BMSCs

注：与假手术组比较，▼P<0.001；与模型组比较，*P<0.001；与左归丸组比较，▽P>0.05

图1 骨细胞CGRP蛋白 ×200A 假手术组弱阳性表达；B 模型组弱阳性表达；C 左归丸组阳性表达；D右归丸组阳性表达Fig.1 Expression of CGRP protein,×200A. Weak positive expression in sham operation group, B. Weak positive expression in model group, C. Positive expression in Zuogui pill group, D. Positive expression in Yougui pill group

图2 SP蛋白表达 ×200A 假手术组弱阳性表达；B 模型组弱阳性表达；C 左归丸组阳性表达；D 右归丸组阳性表达Fig.2 Expression of SP protein, ×200A. Weak positive expression in sham operation group, B. Weak positive expression in model group, C. Positive expression in Zuogui pill group, D. Positive expression in Yougui pill group

图3 VIP蛋白表达 ×200A 假手术组弱阳性表达；B 模型组弱阳性表达；C 左归丸组阳性表达；D 右归丸组阳性表达Fig.3 Expression of VIP protein, ×200A. Weak positive expression in sham operation group, B. Weak positive expression in model group, C. Positive expression in Zuogui pill group, D. Positive expression in Yougui pill group

图4 NPY蛋白表达 ×200A 假手术组弱阳性表达； B 模型组弱阳性表达；C 左归丸组阳性表达；D 右归丸组阳性表达Fig.4 Expression of NPY protein, ×200A. Weak positive expression in sham operation group,B. Weak positive expression in model group, C. Positive expression in Zuogui pill group, D. Positive expression in Yougui pill group

3 讨论

神经系统对骨组织内环境调节是多层次、多元和复杂的, CGRP、SP、VIP、NPY作为骨代谢调节中重要的神经肽及营养因子,在骨吸收和骨形成耦联机制中发挥了极其重要的作用,特别是近年来对神经源性骨质疏松、神经损伤后骨折愈合和异位骨化等深入研究，逐步认识到神经化因素对骨代谢影响的重要性,并提出神经-内分泌-骨的轴线调节理论[1,2]。骨组织CGRP、SP、VIP、NPY的降低与骨质疏松的形成存在着一定的联系。神经肽的减少可能导致其促进骨形成功能的减弱，进一步刺激骨质疏松的形成，这可能是骨质疏松形成的机制之一[3]。

中医药在“肾主骨”理论指导下应用补肾药物治疗骨质疏松症取得了较好的疗效。而随着中医肾本质研究的不断深入，已经认识到肾虚与衰老具有相同的神经内分泌免疫网络功能低下的特征, 而补肾药可以恢复此网络功能[5]。同时，更具创新性的研究表明肾所藏之精可相应于胚胎干细胞及它分化为各种组织器官的成体干细胞。干细胞具有先天之精的属性[6]。补肾药对干细胞神经肽基因表达的的调控更有助于对肾本质的理解。左、右归丸对肾虚证所取得的疗效与其减轻下丘脑-垂体-靶腺的功能损害及修复其功能相关[7]。

基于以上研究成果，本研究选择左、右归丸来干预去卵巢骨质疏松大鼠，观察补肾药对神经肽网络以及干细胞中神经肽基因表达的影响，力图更进一步探索“肾主骨”理论的科学内涵。研究结果表明切除卵巢后大鼠骨组织以及骨髓间充质干细胞中神经肽水平与假手术组比较明显下降，这表明神经肽的缺乏是骨质疏松症发生的原因之一。我们在“肾主骨”理论指导下应用补肾经典名方左、右归丸干预骨质疏松症模型，则干预后神经肽水平显著上升，但仍未达到假手术组的水平，左、右归丸两组之间神经肽水平无明显差异。证明了补肾中药左、右归丸可以作用于神经内分泌轴，从而调节骨代谢。无论滋肾阴还是补肾阳药物均具有调控神经肽网络的作用。大量研究也证实补肾药物可以通过神经-内分泌-免疫(NEI)网络来调节骨代谢[8]。至于左归丸和右归丸调控神经系统与骨组织间信号传导的通路有无不同，仍需进一步研究。补肾药通过提高骨量、调节骨代谢等环节治疗骨质疏松症的疗效已得到证实，本研究结果初步证明补肾药左归丸、右归丸可以提高骨质疏松模型大鼠的神经肽水平，但其通过神经肽网络调控骨代谢的机制仍需深入研究。