葛根素对成骨细胞中miRNA-204的调控及其与Runx2基因表达的关系

张莹莹 周建斌 赵凤鸣 詹秀琴

南京中医药大学基础医学院生物教研室，江苏 南京 210023

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种因骨量低下、骨微结构破坏，导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病(世界卫生组织，WHO)[1]，是由于成骨细胞(OB)形成的新骨量少于被破骨细胞(OC)吸收的旧骨量，骨代谢从而发生负平衡，导致骨总量丢失所致。Runx2是骨发育过程中激活与启动骨髓基质干细胞(BMSCs)向OB分化并调节OB成熟的重要转录因子，上调多种成骨相关基因的表达，对膜内和软骨内骨化成骨均有控制作用，因此，其表达、活性下降与OP发病密切相关。miRNA是一类机体内源性表达的、长度在18到25个核苷酸的非编码小分子RNA，这些仅占人类基因1%的miRNA分子，却可控制人类三分之一以上基因的表达、修饰、转录和翻译过程。它能够在转录后调节基因表达，从而影响多种生物学过程，包括细胞的增殖[2]、分化[3]、凋亡[4]、发育[5]。miRNA的发现可能成为极有应用价值的分子标志物，为骨质疏松症的治疗提供新的靶标。我们以前的研究发现，葛根素可促进成骨细胞增殖和分化，但其机制是否与细胞内的Runx2和miRNA分子有关，且二者之间是否有关联，是本文要研究的问题。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞：MC3T3-E1细胞购自中国科学研究院上海细胞库。

1.1.2药物：葛根素标准品：购自中国药品生物制品检定所，20 mg/支，纯度为96.0%，性状：白色粉末，干燥密封保存。

1.1.3试剂：α-MEM培养基(维森特生物技术有限公司，货号：310010008)；含EDTA的25%胰蛋白酶(GIBCO,USA)；胎牛血清(GIBCO,USA)；miRNA逆转试剂盒(Takara 036A)；Trizol(Invitrogen,USA)；Realtime PCR SYBR premix 2×(Takara RR420A,Japan)；目的基因一抗(rabbit Runx2)(Cell Signaling Technology)；内参一抗(rabbit β-actin)(Cell Signaling Technology)；二抗(Anti-Rabbit IgG HRP)(Cell Signaling Technology)；Trizol(RNAiso for Small RNA)(Takara)；miRNA反转录试剂盒(VaZyMe 公司)；LipofectamineTM2000(Invitrogen,USA)；miRNA所有相关引物由上海生物工程有限公司合成；野生型Runx2 3’UTR/突变型Runx2 3’UTR重组质粒、miRNA-204 mimics 及阴性对照由上海吉马公司合成；miRNA-204扩增采用茎环引物；Runx2和β-actinPCR扩增引物由南京金斯瑞公司合成。

1.1.4主要仪器：二氧化碳细胞培养箱(SANYO,Japan)；相差倒置显微镜(Olympus，Japan)；光镜(Motic)；低温高速冷冻离心机(Eppendorf, USA)；荧光实时定量PCR仪(Agilent Technologies Mx3000P)；紫外分光光度计(BioDrop,USA)；凝胶成像仪(Bio-Rad,USA型号：GelDoc2000)；酶标仪(BioTek,USA)；常温mini 离心机(Eppendorf, USA)；6孔、24孔、96孔细胞培养板(Corning,USA)。

1.2 实验方法

1.2.1荧光实时定量PCR检测Runx2转录水平：按1×105密度在六孔板里接种MC3T3-E1细胞，用含胎牛血清的α-MEM培养液进行培养，设置葛根素处理组和空白对照组, 在葛根素组细胞中加入终浓度为0.01 mg/mL的葛根素，将两组细胞置于37℃、5% CO2培养箱培养72 h。使用Trizol法对细胞进行总RNA的提取,用核酸蛋白分析仪测其浓度和纯度。使用mRNA逆转试剂盒(Takara 036A)逆转录，反应体系参考说明书。荧光实时定量PCR反应体系为：cDNA样品2 μL, Realtime PCR SYBR premix 2× 12.5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,Runx2 Forward：CGGACGAGGCAAGAGTTT CA，Reverse：GGATGAGGAATGCGCCCTAA，扩增片段长度为192bp；β-actin Forward：GTGCTATGTTGC TCTAGACTTCG，Reverse:ATGCCACAGGATTCCATA CC，扩增片段长度为174bp。 加蒸馏水补充至 25 μL。每组设置三个复孔。PCR的反应采用二步法：95℃、30 s预变性,(95℃，5 s; 60℃ 34 s,)×40个循环，做熔解曲线分析。

1.2.2Western blot检测蛋白表达水平：按全蛋白抽提试剂盒说明书提取处理72h后的各组细胞总蛋白，并用BCA法进行蛋白定量，-20℃冻存。取各组样本25 μg进行SDS-PAGE聚丙烯胺凝胶电泳，将分离后的蛋白质电转移到PDVF膜上，放入少量封闭液，室温下，摇床上封闭1 h。TBST漂洗滤膜3次，每次5 min。按约0.1 mL/cm2的量加入一抗抗体和封闭液(1∶1000)，4℃过夜后，TBST漂洗滤膜3次，每次5 min。将膜与HRP结合的二抗(二抗用封闭液稀释1∶3000)，室温下摇荡孵育1 h，TBST漂洗滤膜3次，每次5 min。配制显色液: 按0.1 mL/cm2显影液计算用量，在正面加混匀的显色液,放入凝胶成像仪中显影，调整曝光时间，直至出现最佳条带。

1.2.3microRNA表达谱检测：利用microRNA表达谱检测葛根素作用于成骨细胞72h后发生变化的可能靶向Runx2的miRNA(实验过程由康成生物公司完成)。

1.2.4软件预测靶向Runx2的miRNA：采用miRNA靶基因预测软件TargetScan、PicTar、miRBase和miRDB进行预测，找出可能靶向Runx2的miRNA。同时，将软件预测的miRNA与表达谱测定结果进行比对，确定靶向Runx2的miRNA。

1.2.5PCR验证葛根素作用后靶向Runx2的miRNA变化：细胞培养方法及葛根素作用时间同前、miRNA用Trizol(RNAiso for Small RNA)提取，方法同普通RNA提取。逆转录反应体系： 5×Reverse Transcription Mix 10.0 μL、Stem-loop 反转录引物1.0 μL、miRNA 500 ng、hiscript Enzyme Mix 2.0 μL、加 RNA free H2O至总体积 20 μL。反应条件为：25℃，5 min；45℃，50 min；85℃，5 min；4℃，反应结束后，将其放入-20℃保存。

引物序列：miRNA-204 RT Primer：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGGCAT,Reverse：ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG；U6 RT Primer：AACGCTTCACGAATTTGCGT，Forward：CTCGCTTCGGCAGCACA，Reverse：AACGCTTCACGAATTTGCGT。

Real-time PCR 检测反应体系条件方法同前。

1.2.6构建重组质粒：先合成不含有Runx2基因的空载体(载体序列结构见图)，将空载体(图1)进行单酶切，酶切位点是Xbal，酶切后分别插入野生型Runx2 3‘UTR和突变型Runx2 3’UTR，组合成重组质粒。Runx2 WT 3’UTR序列为：ttctatgcacgtattgtacaaattgtgctttgtgccacaggtcatgatcgtggatgag tttactctgaacttcaaagggactatttgtattgtatgttgcaactgtaaattgaatt atttggcatttccccctctcatgattgtaatatt；Runx2 MT 3’UTR: ttctatgcacgtattgtacaaattgtgctttgtgccacaggtcatgatcgtggatga gtttactctgaacttcaaatccactatttgtattgtatgttgcaactgtaaattgaat tatttggcatttccccctctcatgattgtaatatt。

图1 空载体结构Fig.1 Structure of empty vector

1.2.7双荧光素酶报告基因法验证靶基因：取对数生长期细胞MC3T3-E1，以每孔2×104细胞种于24孔培养板中，充分混匀，置于 37℃培养箱培养 24 h。当融合度接近90%时进行转染。取1.5 mL EP管4个，均加入无血清双抗的α-MEM培养液(按50 μL/孔)和Lipofectamine 2000脂质体(按1 μL/孔)，使其充分混匀，静置5 min。向新的EP管中加入无血清双抗的α-MEM培养液(按50 μL/孔)和Runx2 3’UTR/突变型Runx2 3’UTR重组质粒(100 ng/孔)、miRNA mimics/阴性对照NC(2 μM/孔)，并充分混匀，共分成四组，即Runx2 3’UTR+miRNA mimics、Runx2 3’UTR+miRNA NC、Runx2mut3’UTR+miRNA mimics、Runx2mut3’UTR+miRNA NC。将混有脂质体的α-MEM培养液和上述四组α-MEM培养液分别相混合(100 μL/孔)，并充分混匀，室温下静置20 min，分别加到24孔培养板相应的实验组中(每组设定三个复孔)，混匀放置于37℃ CO2培养箱中培养48 h。

每孔用1×PBS轻柔洗涤1次，每孔加1×PLB(裂解液)，反复吹打，冻融3次，以充分裂解细胞。13000×g，4℃离心15 s，取上清。用荧光检测仪中进行测定，设置2 s的预测延迟和10 s的测定用时，在测量管中加入5 μL样本充分混匀10 s，再加入100 μL Luciferase Reporter Assay Reagent II(LAR II,萤火虫荧光素酶底物)测定萤火虫荧光1，而后加入100 μLStop&Glo©substrate(海肾荧光素酶底物)测定海肾荧光2。以荧光1/荧光2的值作为相对荧光素酶活性。

1.2.8miRNA-204基因的过表达和干扰：在6孔培养板中每孔接种1×105细胞，充分混匀，置于 37℃培养箱培养 24 h，当融合度接近90%时进行转染。取1.5 mL EP管4个，均加入无血清双抗的α-MEM培养液(按200 μL/孔)和Lipofectamine 2000脂质体(按4μL/孔)，使其充分混匀，静置5 min。向新的EP管中加入无血清双抗的α-MEM培养液(按200 μL/孔)和miRNA mimics或miRNA inhibitor 或阴性对照NC(8 μM/孔)，并充分混匀，共分成3组，将混有脂质体的α-MEM培养液和上述两组α-MEM培养液分别相混合(400μL/孔)，并充分混匀，室温下静置20 min，分别加到6孔培养板相应的实验组中，分别为加等量Lipofectamine 2000脂质体孔，加入miRNA mimics组、miRNA inhibitor和阴性对照NC组，混匀放置于37℃ CO2培养箱中培养48 h。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 葛根素对成骨细胞MC3T3-E1 Runx2 mRNA表达水平的影响

葛根素作用72h后，Runx2 mRNA表达量与空白对照组比较具有显著性差异，上升了1.47倍。见图2。

图2 葛根素作用前后Runx2 mRNA表达水平(*P<0.05)Fig.2 The mRNA expression level of Runx2 before and after the addition of puerarin

2.2 葛根素对成骨细胞MC3T3-E1 Runx2蛋白表达水平的影响

同空白组相比,葛根素作用后Runx2的蛋白水平上升。见图3。

图3 葛根素作用前后Runx2 蛋白的比值Fig.3 The protein ratio of Runx2 before and after the addition of puerarin1. Puerarin group 2. Blank control group

2.3 靶向Runx2的miRNA预测结果

综合利用TargetScan、PicTar、miRBase和miRDB这四个软件预测结果显示靶向Runx2的miRNA有miR-204、miR-128、miR-135b-5p、miR-3072-3p、miR-2861、miR-770-5p。microRNA表达谱检测结果显示miR-204、miR-3072-3p、miR-2861等119个microRNA葛根素作用前后发生变化。其中共同交集有miR-204、miR-3072-3p等4个，我们选择miR-204作为研究对象验证靶基因预测的正确性。

序列(5’ TO 3’)mmu-miR-204 mimics：UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU；mmu-miR-204 Inhibitor：AGGCAUAGGAUGACAAAGGGAA；mmu-miR-204NC:GCGACGAUCUGCCUAAGAU。

2.4 葛根素作用后miRNA-204表达量的变化

荧光实时定量PCR结果显示(图4)，葛根素作用后miRNA-204 在成骨细胞中的表达显著低于空白对照组，表达差异有显著的统计学意义(P<0.05)。初步说明了Runx2可能为miRNA-204的靶基因。

图4 miRNA-204表达水平(*P<0.05)Fig.4 The expression level of miRNA-204

2.5 双荧光素酶报告基因法结果

图5 miRNA-204对Runx2 3’UTR表达的影响(*P<0.05) Fig.5 Effect of miRNA-204 on expression of Runx2 3’UTR

双荧光素酶报告基因法结果显示(图5)，细胞转染48 h后，只有Runx2 3’UTR+miRNA-204 mimics组荧光素蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)，说明只有miRNA-204可抑制Runx2 3’UTR报告基因的表达，miRNA-204+Runx2mut3’UTR组、miRNA-204NC+Runx2 3’UTR组和miRNA-204NC+Runx2mut3’UTR组荧光素蛋白的表达水平均变化不显著(P>0.05)，表明了Runx2 为miRNA-204的靶基因。

2.6 过表达或干扰miRNA-204对Runx2蛋白表达的影响

与空白对照组相比，转染试剂组Runx2蛋白表达水平有一定程度的下降(图6)，说明转染试剂对细胞蛋白表达有一定的抑制作用。因此，miRNA-204对Runx2蛋白表达的影响，应以转染试剂组为比较对象。结果显示：同转染试剂组相比,miRNA-204过表达后Runx2的蛋白水平下降, miRNA-204干扰表达后Runx2的蛋白水平上升，且都有统计学意义。进一步验证了Runx2 为miRNA-204的靶基因。

图6 过表达或干扰miRNA-204后Runx2蛋白表达的水平(*P<0.5，**P<0.01)1转染试剂组 2 NC对照组 3 miR-204mimics组 4 miR-204inhibitor组Fig.6 The protein level of Runx2 after overexpression or interference of miRNA-2041, Transfection reagent group; 2, NC control group; 3, miR-204mimics group; 4, miR-204inhibitor group

2.7 过表达或干扰miRNA-204对Runx2 mRNA表达的影响

与转染试剂组相比,miRNA-204过表达以及干扰表达后Runx2 mRNA表达水平均没有明显差异，说明miRNA-204对Runx2 mRNA表达没有明显作用，不参与Runx2的转录过程，而参与翻译调节。

图7 过表达或干扰miRNA-204后Runx2 mRNA表达的水平Fig.7 The mRNA level of Runx2 after overexpression or interference of miRNA-204

3 讨论

Runx2 的表达是成骨细胞分化的开始，它使骨髓基质干细胞只发育成成骨细胞或软骨细胞[6]，因此是骨形成过程中最早和最具特征性的标志[7]，Runx2亦是骨发育过程中激活与启动骨髓基质干细胞向成骨细胞分化并调节成骨细胞成熟的重要转录因子，它能上调多种成骨相关基因的表达，对膜内和软骨内骨化成骨均有控制作用，参与正常骨骼发育的全过程，对防治骨质疏松症具有重要意义。

miRNA是细胞内的一类小分子RNA，能够在转录后调节基因表达，从而影响多种生物学过程，包括细胞的增殖、分化、凋亡、发育。它的发现可能成为极有应用价值的分子标志物，为骨质疏松症的治疗提供新的靶标。

前期研究发现葛根素能促进成骨细胞增殖与分化，对骨量保持具有正向意义从而达到防治骨质疏松的目的[8,9]。本实验表明，葛根素作用于成骨细胞后,能上调成骨细胞Runx2的表达，同时，miRNA表达谱也有很大的改变，推测葛根素对Runx2蛋白表达的影响可能与miRNA有关。

Wang等[10]体外实验表明，miR-204负调节Runx2抑制成骨分化，从而抑制成骨细胞相关基因的表达，包括碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素，这些都是由BMP-2诱导产生的。Huang等[11]也发现，miR-204作为重要的内源性衰减器负调控Runx2，抑制间充质祖细胞系和骨髓间充质干细胞中骨生成和促进脂肪生成。说明Runx2可作为MiR-204的直接靶标[12]。

我们的实验表明，miRNA表达谱和PCR结果都发现葛根素作用后miRNA-204表达下降，说明了Runx2和MiR-204的表达呈负相关。我们采用生物信息学分析发现，miR-204能与Runx2的3 '非翻译区特异性结合从而抑制其翻译。

为进一步验证miR-204和Runx2之间的关系，我们构建了Runx2 3‘UTR和突变型Runx2 3’UTR的表达载体，采用荧光素酶报告基因法证实了Runx2是miRNA-204的靶基因，而且，过表达miRNA-204可使Runx2蛋白表达下降，干扰miRNA-204则使Runx2蛋白表达上升，这些结果都说明在成骨细胞中，miRNA-204直接抑制Runx2表达，Runx2可作为miRNA-204的直接靶标。葛根素可通过下调miRNA-204来促进Runx2表达、促进成骨细胞增殖和分化，实现预防和治疗骨质疏松症的作用。