脑星形细胞瘤中HPA的表达及其对肿瘤细胞侵袭力的影响

刘宏雷　易力　翟晓莉



·论著·

脑星形细胞瘤中HPA的表达及其对肿瘤细胞侵袭力的影响

刘宏雷易力翟晓莉

050011河北省石家庄市第三医院神经外科(刘宏雷),病理科(翟晓莉)；河北医科大学第二医院病理科(易力)

【摘要】目的观察乙酰肝素酶(HPA)在人脑星形细胞瘤组织的表达及对肿瘤细胞侵袭力的影响。方法采用免疫组化ElivisionTMplus两步法和Real time-PCR法检测75例星形细胞瘤组织和40例正常脑组织中HPA蛋白和mRNA表达情况。通过siRNA干扰技术沉默星形细胞瘤U87细胞中HPA表达，采用Real time PCR、Western blot、Transwell小室实验检测肿瘤细胞HPA、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达及细胞侵袭力变化。结果正常脑组织未见HPA蛋白表达，星形细胞瘤组织中HPA阳性表达率为78.67%(59/75)，星形细胞瘤组织HPA阳性表达率显著高于正常脑组织，且其mRNA表达水平也显著高于正常脑组织，差异有统计学意义(P<0.05)。星形细胞瘤Ⅱ～Ⅳ级组，HPA阳性表达率逐渐增加，差异有统计学意义(P<0.05)；且有转移组HPA阳性表达率显著高于无转移组(P<0.05)。siRNA能够有效抑制星形细胞瘤U87细胞中HPA表达，并下调VEGF、MMP-9表达，同时穿膜细胞数显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)。结论HPA在星形细胞瘤组织异常高表达，随着肿瘤恶性程度增高而逐渐升高。siRNA沉默HPA后细胞侵袭力显著降低，HPA有可能成为治疗星形细胞瘤的潜在靶点。

【关键词】星形细胞瘤；乙酰肝素酶；侵袭

脑星形细胞瘤是最常见的成人原发脑肿瘤，其发生率逐年递增，约占原发性恶性脑肿瘤的70%[1]。尽管神经影像学的快速发展极大帮助了星形细胞瘤的诊断和治疗，对星形细胞瘤的治疗技术也取得了较大的进步，但其临床效果并不理想，主要原因为星形细胞瘤大多呈侵袭性生长，手术难以切底根治[2]。乙酰肝素酶(Heparanase，HPA)是近年发现的一种细胞外基质降解酶，其能够破坏由细胞外基质与血管基底膜组成的天然屏障结构，在肿瘤细胞浸润和转移过程中发挥重要作用。大量研究证实，HPA在多种恶性肿瘤中异常高表达[3]。本研究检测了HPA在不同病理分级星形细胞瘤组织中的表达，并通过siRNA干扰技术沉默星形细胞瘤U87细胞中HPA表达，观察其对侵袭转移相关基因血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达和细胞侵袭力的影响。

1资料与方法

1.1一般资料肿瘤组织标本来自于河北医科大学第二医院和石家庄市第三医院。自2004年1月至2014年12月共收集到资料完整的75例原发性星形细胞瘤患者。所有病例保存的石蜡组织切片均由两位高年资病理医师按2010年WHO《神经系统肿瘤》进行诊断复核。所选取的75例标本中，男45例，女30例；年龄12～78岁，平均年龄(59±25)岁；病理分级：Ⅱ级25例，Ⅲ级29例，Ⅳ级21例。浸润深度：累及浆膜者44例，未累及浆膜者31例。另随机选取颅脑损伤后行颅内减压患者的正常脑组织40例作为对照，其中男28例，女12例；年龄21～65岁，平均年龄(41±12)岁。

1.2实验方法及试剂

1.2.1免疫组织化学:每例石蜡组织均取切片3张，应用免疫组织化学ElivisionTMplus两步法染色，用已知阳性切片作对照，用PBS液染色作为阴性对照。所用一抗为小鼠抗人HPA单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，ElivisionTMPlus免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒均购于福州迈新生物技术开发有限公司。 结果判定：HPA阳性部位在胞核和胞浆，呈棕黄色颗粒，不出现为阴性。高倍镜下，在每一张切片的角及中央各取5个高倍视野，计算100个癌细胞中阳性细胞所占的比例，取平均值。然后，按染色强度计分：0～3分分别为无色、淡黄色、黄色、棕黄色；按阳性细胞所占百分比计分：0分为阴性，1分、2分、3分和4分分别为阳性细胞占<11%、11%～50%、51%～75%和>75%，计算方法为：染色强度×阳性细胞所占百分比；其中：>3分为(+)，6～9分为(++)，10～12分为(+++)，凡(+)或(+)以上者为阳性表达。

1.2.2细胞培养基转染:在37℃ 5% CO2孵箱中用含10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养U87细胞，将对数生长期的细胞接种于培养皿中，调整细胞密度为1×105个/ml，待细胞融合至30%～50%，将细胞分3组：①空白对照组；②阴性对照组：转染空质粒；③转染组：转染HPA-siRNA。

1.2.3Real time-PCR:Trizol提取组织或细胞总RNA，按照试剂盒说明书加样进行逆转录反应，ABI 7300型荧光定量PCR仪扩增。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用仪器自带的分析软件得到各样本、各基因扩增的Ct值，以β-actin为内参照基因，目的基因表达相对值RQ=2ΔΔCt。见表1。

表1　Real time PCR引物序列

1.2.4Western-blot:收集、裂解细胞，提取细胞总蛋白，4℃、12 000 r/min离心30 min，取上清。半干法电泳转移至PVDF膜，10%脱脂奶粉封闭2 h。依次加入特异性一抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，化学发光法显色、定影。用UVP软件扫描测定蛋白条带IOD值，计算目的蛋白与内参照β-actin的比值。

1.2.5Transwell小室实验:用预冷无血清DMEM培养基稀释Matrigel，转染后的细胞制成细胞悬液，调整细胞密度为3×105/ml，Transwell小室上室加入100 μl细胞悬液，下室加入600 μl含10% BSA的DMEM培养基。37℃、5% CO2培养箱中孵育18 h，弃去培养基，PBS清洗，甲醛室温固定15 min。用棉签轻拭上表面的细胞，苏木素染色，室温干燥过夜。将微孔膜置于载玻片上，显微镜下计数穿膜细胞数，重复3次，取均值。

2结果

2.1脑星形细胞瘤及正常脑组织中HPA的表达情况

2.2.1免疫组化结果显示：HPA阳性染色部位定位于胞核和胞浆，呈棕黄色颗粒，在75例星形细胞瘤组织和40例正常脑组织中HPA蛋白阳性表达率分别为78.67%(59/75)、0(0/40)，HPA蛋白在星形细胞瘤组织的阳性表达率显著高于正常脑组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2　2组HPA蛋白阳性表达率比较　例(%)

注：与正常脑组织比较,*P<0.05

2.2.2Real time-PCR结果显示HPA mRNA在星形细胞瘤组织和正常脑组织的表达水平分别为1.92±0.31、0.00±0.00，HPA mRNA在星形细胞瘤组织的表达水平显著高于正常脑组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3　HPA在不同病理分级星形细胞瘤组织的表达情况　±s

注：与正常脑组织比较,*P<0.05

2.2HPA与脑星形细胞瘤组织病理分级的关系HPA在不同病理分级星形细胞瘤组织的阳性表达率分别为60.00%(15/25)、79.31%(23/29)、90.48%(19/21)，HPA在Ⅳ级星形细胞瘤组织的阳性表达率显著高于Ⅲ级星形细胞瘤组织，而后者显著高于Ⅱ级星形细胞瘤组织，提示HPA的阳性表达率随着星形细胞瘤分化程度降低呈现线性升高趋势。见表4。

表4　HPA在无转移和有转移星形细胞瘤组织的表达情况　例

注：与Ⅱ级比较，*P<0.05

2.3HPA与转移的关系HPA在无转移和有转移的星形细胞瘤组织的阳性表达率分别为61.29%(19/31)、95.45%(42/44)，HPA在有转移的脑星形细胞瘤组织的阳性表达率显著高于无转移的脑星形细胞瘤组织，提示HPA的阳性表达率与脑星形细胞瘤是否转移有关。见表5。

表5　HPA与转移的关系　例

注：与无转移比较，*P<0.05

2.4HPA siRNA对U87细胞中HPA mRNA和蛋白表达的影响Real time-PCR和Western-blot结果显示：HPA siRNA转染后48 h，U87细胞中HPA mRNA和蛋白表达显著降低，与空白对照组和阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，而空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，说明HPA siRNA可以有效沉默HPA表达。见表6。

组别HPAmRNA表达水平HPA蛋白表达水平转染组0.18±0.030.14±0.02阴性对照组0.67±0.11*0.60±0.10*空白对照组0.65±0.10*0.55±0.09*

注：与转染组比较,*P<0.05

2.5HPA siRNA对U87细胞中VEGF mRNA和蛋白表达的影响Real time-PCR和Western-blot结果显示：HPA siRNA转染后48 h，U87细胞中VEGF mRNA和蛋白表达显著降低，与空白对照组和阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，而空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，说明HPA siRNA可以显著抑制VEGF表达。见表7。

组别VEGFmRNA表达水平VEGF蛋白表达水平转染组0.21±0.030.17±0.02阴性对照组0.89±0.14*0.79±0.12*空白对照组0.90±0.15*0.77±0.11*

注：与转染组比较,*P<0.05

2.6HPA siRNA对U87细胞中MMP-9 mRNA和蛋白表达的影响Real time PCR和Western-blot结果显示：HPA siRNA转染后48 h，U87细胞中MMP-9 mRNA和蛋白表达显著降低，与空白对照组和阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，而空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，说明HPA siRNA可以显著抑制MMP-9表达。见表8。

组别MMP-9mRNA表达水平MMP-9蛋白表达水平转染组0.15±0.020.11±0.02阴性对照组0.76±0.12*0.68±0.11*空白对照组0.74±0.11*0.64±0.10*

注：与转染组比较,*P<0.05

2.7HPA siRNA对U87细胞侵袭力的影响Transwell小室实验结果显示：HPA siRNA转染后48 h，转染组、阴性对照组、空白对照组穿膜细胞数分别为(21±3)、(51±7)、(53±9)个，转染组穿膜细胞数较阴性对照组、空白对照组显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)，而空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，说明HPA siRNA可以显著降低U87细胞侵袭力。

3讨论

星形细胞瘤起源于胚胎外胚层，是最常见的脑组织肿瘤，其发生率逐年递增，据资料统计，星形细胞瘤约占原发性恶性脑瘤的70%[1]，居颅脑肿瘤的第一位，是严重危害人类生命健康的一类疾病，且其预后常常欠佳[4]。星形细胞瘤的生物学特征具有特殊性，表现为无论其分化程度高低，均呈现浸润性生长。虽然神经影像学的快速发展，极大帮助了星形细胞瘤的诊断和治疗；医学治疗手段的不断进步和多样化，提高了星形细胞瘤患者的生存率，但星形细胞瘤患者的预后仍不理想。

星形细胞瘤患者病死率高的主要原因是肿瘤的侵袭性生长和转移。恶性肿瘤的侵袭性生长必须降解细胞外基质(ECM)中的各种成分和硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)，然后才能穿过由细胞外基质(ECM)和血管基底膜(BM)组成的屏障。HPA是近年发现的一种ECM降解酶，从人的胎盘组织及血小板克隆得到。Hulett等[5]研究认为HPA是一种细胞膜蛋白，可以降解BM和ECM中的HSPG，对HSPG的转录进行调节；而且在多种转移瘤细胞系中HPA都出现高表达现象，并且在转染了HPA cDNA的细胞系中也表现为高转移特性。目前研究发现HPA在乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌等多种原发性肿瘤组织中异常高表达，在恶性肿瘤持续病理学状态中起重要作用[6-14]，且其表达增加与肿瘤患者术后生存期缩短、转移和微血管密度增加相关[3]。

本研究收集的75例星形细胞瘤标本中有59例HPA表达阳性，阳性率为78.67%，而在正常脑组织中却未发现其阳性表达，而且随着星形细胞瘤病理级别的升高其表达随之升高，说明HPA参与了星形细胞瘤发生发展。此外，本研究利用siRNA干扰技术成功造成HPA基因沉默，结果发现星形细胞瘤U87细胞侵袭力显著降低，同时VEGF、MMP-9表达显著下调，进一步证实HPA高表达与肿瘤侵袭转移密切相关，其表达水平可作为评判肿瘤复发转移的可靠指标。

综上所述，HPA高表达在星形细胞瘤发生发展和侵袭转移过程中发挥重要作用。通过基因靶向治疗下调HPA表达有可能实现抑制肿瘤侵袭转移的目的。HPA可作为判断星形细胞瘤生物学行为的标志物和治疗该肿瘤的潜在靶点[15-18]。

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doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.14.013

【中图分类号】R 730.264.1

【文献标识码】A

【文章编号】1002-7386(2016)14-2130-04

(收稿日期：2016-01-11)

Expression of HPA in human astrocytoma and its effects on invasiveness of tumor cells

LIUHonglei*,YILi,ZHAIXiaoli.*

DepartmentofNeurosurgery,TheThirdHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050011,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of heparanase (HPA) in human astrocytoma and its effects on invasiveness of tumor cells.MethodsThe expression levels of HPA were detected by immunohistochemical assay and Real time-PCR in 75 cases of human astrocytoma tissues and 40 cases of normal brain tissues. The small interfering RNA (siRNA) knockdown technique was used to silence the expressions of PHA protein and mRNA in astrocytoma U87 cells.The expression levels of HPA,vascular endothelium growth factor (VEGF), matrix metalloproteinases-9 (MMP) as well as the changes of invasiveness of tumor cells were detected by Real time-PCR, Western Blot and Transwell assay.ResultsThe expressions of PHA were not observed in normal brain tissues. The positive expression rate of HPA protein was 78.67% (59/75) in astrocytoma tissues, which was significantly higher than that [0(0/40)] in normal brain tissues (P<0.05),moreover, the positive expression rate of HPA mRNA was significantly higher than that in normal brain tissues (P<0.05). The positive expression rate of HPA at gradeⅡ～Ⅳof astrocytoma was gradually increased,and the positive rate was 60.00% (15/25), 79.31% (23/29), 90.48% (19/21),respectively,and there was a significant difference among them (P<0.05).Furthermore the positive expression rate of HPA in tumor metastasis group was significantly higher than that in non-metastasis group (P<0.05).The siRNA could effectively inhibit the expressions of HPA in U87 cells and could down-regulate the expressions of VEGF,MMP-9,at the same time, which could obviously decrease the cell counts of permeating cell membrane (P<0.05).ConclusionThe high-expressions of HPA exist in astrocytoma tissues,moreover,which are gradually increased with the malignant degree of tumor.The invasiveness of tumor cells is obviously decreased afterHPA is silenced by siRNA,thus,PHA may become a potential target point in treatment of astrocytoma.

【Key words】astrocytoma; heparanase;invasion