SHIP2在非小细胞肺癌中的表达及意义

张鉴　袁崎　傅茂英



·论著·

SHIP2在非小细胞肺癌中的表达及意义

张鉴袁崎傅茂英

215300江苏省昆山市，江苏大学附属昆山市第一人民医院综合外科

【摘要】目的研究SHIP2在非小细胞肺癌中的表达,探讨其表达与非小细胞肺癌预后之间的关系。方法应用qPCR和免疫组织化学方法(IHC)分析SHIP2在非小细胞肺癌中的表达。使用Kaplan-Meier统计方法和Cox比例风险回归模型来进行生存分析，评估100例非小细胞肺癌患者的预后。结果SHIP2在非小细胞肺癌的表达明显高于非肿瘤组织(P<0.05)。SHIP2的表达与淋巴结转移(P=0.042),TNM阶段(P=0.036),5年生存率(P=0.046)有关。Kaplan-Meier统计方法和时序检验分析进一步表明SHIP2高表达、吸烟、晚期肿瘤和预后不良显著相关。结论SHIP2表达和非小细胞肺癌的恶性表型相关，可以作为非小细胞肺癌独立预后因素和重要致癌基因。

【关键词】SHIP2；非小细胞肺癌；聚合酶链式反应；免疫组织化学；预后

肺癌是全球常见、致命的恶性肿瘤[1,2]。在我国, 过去的三十年肺癌的病死率增加了400%,是第二大死因[3]。肺癌包括小细胞肺癌(SC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，后者约占85%。早期NSCLC患者术后的长期生存率较高。然而,大多数的NSCLC患者(占80%)诊断时已经处于晚期。尽管NSCLC诊断和治疗技术不断改善,但患者的预后仍然很差,5年生存率仍然较低(15%)[4,5]。目前,研究人员正在关注与NSCLC预后相关的标志物[6,7]。寻找与预后因素相关的重要基因，以期能够增加潜在治疗靶点的选择和对NSCLC的治疗。SHIP2被认为下调磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信号,导致了多种人类癌症的进展[8-10]。最近的两项研究表明,SHIP2有致瘤的特征, SHIP2高表达与乳腺癌预后和喉鳞状细胞癌相关(LSCC)[11,12]。这些发现表明,在肿瘤发生中SHIP2扮演关键角色。因此,SHIP2可能是人类癌症候选生物标志物，对预后有着预测作用。然而, NSCLC SHIP2的表达与临床病理的相关性的实质性的作用机制尚未阐明。本研究中，我们选择SHIP2作为研究对象，运用qPCR和免疫组织化学方法(IHC)检测NSCLC中SHIP2含量及相应表达情况，并根据组织芯片(TMA)建立的非小细胞肺癌患者数据库，分析SHIP2与NSCLC临床病理学特征及预后的关系。

1资料与方法

1.1一般资料100例甲醛固定,石蜡包埋的NSCLC肿瘤(其中肺腺癌45%,肺鳞癌55%)标本来源于2005至2006年我院患者。患者年龄35～81岁，平均年龄(手术时)(60.4±2.8)岁。收集相关的临床数据,包括性别、年龄、肿瘤大小、组织学类型、吸烟状况、肿瘤分化,TNM阶段,淋巴结转移,5年随访生存。患者术前均未接受放疗、化疗、或免疫疗法。16例新鲜冷冻NSCLC肿瘤标本(8例腺癌和8例鳞癌)和相邻瘤旁组织样本来源于我院。

1.2qPCR检测分析采用Trizol试剂(Life Technologies公司, 格兰德艾兰, 纽约)从16例新鲜NSCLC组织以及相应的癌旁组织中细胞中提取总RNA，根据产品使用说明书进行qPCR检测分析。SHIP2的引物如下:正向引物5’-TCGTCACCAGCGACCATT C-3’;反向引物5’-AGCCCTTTCTTGGAGATGAACTG-3’。内参GAPDH引物如下:正向引物5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，反向引物3’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-5’。

1.3组织芯片制作TMA由上海芯超生物公司定制。TMA被切成4 μm大小，使用多克隆山羊抗SHIP2抗体(Santa Cruz Biotechnology公司,圣克鲁斯,加州,美国)在全自动免疫组化染色系统(LabVision公司,卡拉马祖，密歇根州，美国)下分别染色。二抗使用山羊抗辣根过氧化物酶HRP抗体(Dako Cytomation公司，卡平特里亚，加州，美国)。IHC结果分析按照既往IHC分析方法进行分析[13,14]。SHIP2免疫组化染色评分(HIS)由2个独立的病理学专家根据染色强度和SHIP2阳性细胞的百分比得出。每个切片随机选择4个视野,使用免疫组织化学评分(IHS)方法来评估阳性染色百分比。IHS通过评估染色密度和强度分析结果，染色强度评分：0(阴性)，1(弱阳性)，2(阳性)，3(强阳性)。SHIP2阳性细胞百分率也根据以下评分分为四类：1代表0～10%，2代表11%～50%，3代表51%～80%，4代表81%～100%。两者分数之和得出最终的HIS分值：总分低于3的样本(IHS≤3)被认为是SHIP2低表达，为阴性表达。而以总分4以上(IHS≥4)为SHIP2高表达，为阳性表达。

1.4统计学分析应用STATA 12.0统计软件，新鲜NSCLC组织与癌旁正常组织SHIP2 mRNA表达比较应用Wilcoxon符号秩检验进行分析。计数资料采用χ2检验，对预后重要因素进行单变量和多变量分析。SHIP2表达与NSCLC患者预后之间关系使用Kaplan-Meier统计方法进行生存分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1应用qPCR检测NSCLC组织标本中SHIP2 mRNA的表达检测提取自16例新鲜NSCLC组织和相应的癌旁正常组织的总RNA中SHIP2 mRNA表达。SHIP2 mRNA在NSCLC组织中(4.34±0.133)的表达显著高于相应的癌旁正常组织(2.12±0.064) (P<0.05)(以GAPDH作为蛋白质内参), SHIP2在非小细胞肺癌样本的表达比相应的癌旁正常组织高出约2.05倍。见图1。

2.2SHIP2表达与NSCLC临床病理特征之间的联系SHIP2的高表达是与淋巴结转移(P=0.042),TNM阶段(P=0.036),5年生存率(P=0.046)相关。SHIP2与其他参数,如性别、年龄、肿瘤直径、组织学类型、吸烟状态和肿瘤分化无明确相关性。见表1。

图1SHIP2 mRNA在16例新鲜NSCLC组织和相应的癌旁正常组织的表达

表1　SHIP2高表达与NSCLC临床病理特点的关系

2.3应用免疫组化法(IHC)检测NSCLC TMA中SHIP2表达观察到在NSCLC 中SHIP2有高表达 55(55.0%)。对照组肿瘤癌旁肺组织样本相比只有16(16.0%)，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

2.4生存分析对所有相关因素使用Cox回归模型进行单变量分析, SHIP2的高表达有统计学意义(P=0.004)，可以作为NSCLC预后因子。吸烟状态(P=0.035)和肿瘤TNM阶段(P=0.047)也与患者的存活率密切相关。在Cox回归模型中的多变量分析证明SHIP2表达(P=0.001),吸烟状态(P=0.009),与肿瘤TNM阶段(P=0.009)是生存最重要的预测因子。Kaplan-Meier生存曲线表明, NSCLC患者SHIP2的低表达、不吸烟、早期的TNM阶段明显有利于延长患者的生存时间。见表2，图3。

图2SHIP2蛋白在NSCLC组织和癌旁正常组织TMA中IHC染色的表达

注：A1.癌旁阴性(免疫组化×40)；A2.癌旁阴性(免疫组化×400)；B1.NSCLC阳性(免疫组化×40)；B2.NSCLC阳性(免疫组化×400)；C1.癌旁阳性(免疫组化×40)；C2.癌旁阳性(免疫组化×400)

表2　NSCLC 5年生存预后因素的单变量和多变量分析

图3　100例NSCLC患者应用kaplan meier生存分析

3讨论

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (P13K/Akt)信号转导通路作为细胞生存重要通路之一，它的异常改变是肿瘤细胞的重要生物学特性，细胞在一系列内外因素的作用下，通过启动P13K/Akt信号转导通路，诱导细胞的增殖、分化，避免细胞发生凋亡。P13K/Akt信号转导通路在肿瘤细胞恶性增殖、血管新生和转移以及对放化疗的拮抗中起着重要作用。目前认为脂质磷酸酶SHIP蛋白的研究具有重要的地位。含有肌醇环5’磷酸酶的SH2结构域(SH2 domain-containing inositol 5’-phosphatase，SHIP)有SHIP1和SHIP2两种同源物, N端为SH2结构域；中间部位为磷脂酰肌醇5`磷酸酶的催化中心，酪氨酸的磷酸化是活化的表现；SHIP的C端为富含脯氨酸的区域。长期以来人们一直认为SHIP1和SHIP2通过抵消P13K/Akt信号通路途径来抑制肿瘤生长。它通过其5’磷酸酶特异性水解PI(3、4、5)P(3)生成PI(3、4)P(2)，负向调节PI3-K活性，导致PI3-K下游分子活性下降，进而负向调节PI3-K/Akt依赖的信号转导通路，起到负调控作用[15，16]。PIP3是重要的第二信使，通过PI3K参与调节各种细胞功能，包括细胞生存、黏附和迁移[17,18]。PI3K通路与癌症发展密切相关。因此, 信号通路的特定位置可能成为抗癌治疗的靶点[19]。SHIP2促进PIP3脱磷酸生成PIP2,抑制P13K/AKT信号通路活化,达到抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用。潜在的影响途径包括PI3K/AKT信号级联[20]、Ras和促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)[21]等。

最近的一项研究报道发现在乳腺癌细胞中SHIP2存在高表达，它促进了细胞的增殖, 对小裸鼠针对性的抑制SHIP2可以抑制肿瘤生长和转移[19]。此外, 现在临床中已经开始检测乳腺癌组织中SHIP2蛋白的表达，研究发现SHIP2蛋白在乳腺癌组织中的含量比在非乳腺癌组织样本明显增高,这表明SHIP2可以作为具有乳腺癌预后意义的生物标志物[11]。这些发现表明SHIP2可以是癌症治疗策略中一个新颖的抗癌靶点。因此,我们研究在NSCLC 中SHIP2的表达与不同临床及病理参数的关系，从而为SHIP2对NSCLC的预后影响提供依据。本研究中,qPCR和IHC的结果是一致的, 在我们应用qPCR检测NSCLC组织标本中SHIP2 mRNA的表达中，16例新鲜NSCLC组织中SHIP2 mRNA水平(4.34±0.133)显著高于相应的癌旁正常组织(2.12±0.064) (P<0.05),SHIP2在非小细胞肺癌样本的水平比相应的癌旁正常组织高出约2.05倍。IHC试验中，SHIP2在非小细胞肺癌的表达明显高于非肿瘤组织(P<0.05)。Kaplan-Meier统计和时序检验分析表明SHIP2高表达、吸烟、晚期肿瘤和预后不良显著相关。表明相比邻近组织，NSCLC有着更高的SHIP2表达,这表明SHIP2表达在NSCLC肿瘤发生中扮演了一个重要的角色。SHIP2的表达,主要局限在NSCLC细胞的细胞膜和细胞质, 和以前在喉鳞状细胞癌发现的结果相同[12]。此外,我们发现SHIP2高表达与NSCLC临床病理特征相关，SHIP2的表达与淋巴结转移(P=0.042), TNM阶段(P=0.036),5年生存率(P=0.046)有关。单变量分析结果表明,SHIP2表达、吸烟状况和TNM阶段与NSCLC患者的寿命相关。多变量分析结果证明在NSCLC不良预后因素中， SHIP2高表达、吸烟和TNM晚期阶段是独立的预后因素。生存分析数据也符合上述结论。

综上所述,SHIP2可以用作NSCLC的预后生物标志物。SHIP2的高表达与预后不良有关。以后，我们需要进一步的实验来证明SHIP2参与NSCLC表达潜在的机制。

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doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.14.005

【中图分类号】R 734.2

【文献标识码】A

【文章编号】1002-7386(2016)14-2101-04

(收稿日期：2016-01-11)

Expression and significance of SHIP2 in non-small cell lung cancer

ZHANGJian,YUANQi,FUMaoying.

DepartmentofComprehensiveSurgery,TheFirstPeople’sHospitalofKunshanCity,Jiangsu,Kunshan215300,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of SHIP2 in human non-small-cell lung carcinoma (NSCLC),and to explore the correlation between its expression and prognosis of NSCLC.MethodsThe one-step quantitative-PCR (qPCR) and immunohistochemistry (IHC) assay were performed to detect the expression of SHIP2 in NSCLC. The Kaplan-Meierstatistical method and log-rank test were used to evaluate the prognosis of 100 patients with NSCLC.ResultsThe expression levels of SHIP2 RNA and protein in NSCLC were significantly higher than those in corresponding non-cancerous tissues (P<0.05). The expression of SHIP2 in NSCLC was closely correlated to lymph node metastasis, TNM stage, 5-year survival rate (P<0.05). The results by Kaplan-Meierstatistical method and log-rank test showed that the high-expression of SHIP2, smoking and advanced tumor were closely related with unfavourable prognosis of patients with NSCLC.ConclusionSHIP2 expression is correlated to malignant phenotypes of NSCLC,which can be regarded as an important carcinogenic gene and independent prognosis factor of NSCLC.

【Key words】SHIP2；non-small-cell lung carcinoma；PCR；immunohistochemistry；prognosis