A549细胞冻存与复苏方法的改进

季晓宇　鞠晓梅　汤　贺　姜　萌　罗来鹏　刘宇轩　侯毅鞠



A549细胞冻存与复苏方法的改进

季晓宇鞠晓梅汤贺姜萌罗来鹏刘宇轩侯毅鞠

吉林医药学院检验学院

季晓宇（1995-）女（汉族），河北省保定市人，在读本科；通讯作者：侯毅鞠（1974-）女（汉族），吉林省吉林市人，副教授，硕士学位，主要从事血液肿瘤相关的研究工作。

行业曲线

起始于20世纪早期的细胞培养技术作为生命科学研究最基础的环节，随着分子生物学实验技术的发展，在生物学研究领域得到了广泛应用，如培养肿瘤细胞是研发抗肿瘤新药的常规技术 。A549是1972年由Giard DJ通过肺癌组织移植培养建系的一种肺癌细胞。我们以A549细胞为例，研究细胞培养中最基本但又很关键的冻存与复苏的方法和条件，使A549冻存复苏后获得最高生物学特性，推动后期实验顺利进行。

实验所需材料与方法

实验材料

A549肺癌细胞，RPMI-1640培养基（GIBCO公司），胎牛血清（四季青），DMSO（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），胰蛋白酶（北京鼎国生物技术有限公司），CO2培养箱，倒置显微镜，超净工作台。

实验方法

A549细胞的培养及传代

在温度为37℃±1、CO2浓度为5%培养箱内，用胎牛血清为10%的RPMI-1640培养基进行培养，待细胞生长至80%～90%即可传代培养：弃去培养液后加入适量胰酶，37℃消化1～2 min，见有细小白沙状物顺瓶底滑脱，显微镜下观察到大部分细胞呈现圆形，细胞间隙增大后，立即加入完全培养液终止消化，收集细胞悬液，800 r·min-1，5min离心，去掉上清，加入10%胎牛血清的RPMI-1640培养基以后吹打混匀，按照1∶2进行传代培养。

不同浓度DMSO冻存A549细胞

常用的细胞冻存液为含10%二甲基亚砜、20%胎牛血清、70% RPMI-1640的培基。取生长状态良好的A549细胞，待贴壁生长至80%～90%时，按前述方法消化细胞，待消化充分后，收集细胞悬液进行离心，将细胞分成密度相同的 4 组，冻存保护液DMSO终浓度依次为 5%、10%、15%、20%分装于冻存管，冷冻保存。15天后取出，置于37℃水浴中轻轻晃动，迅速溶解，800 r·min-1，5min离心，去掉上清，加入10%胎牛血清的RPMI-1640培养基以后吹打混匀，于温度为37℃±1、CO2浓度为5%培养箱内进行培养。

A549细胞的复苏

选择冻存条件最优的细胞（10%DMSO浓度冻存的A549细胞），选用两种不同方法来复苏。第1组：冻存管立即放于37℃水浴，轻晃至融化后加入等量10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，800 r·min-1离心5min，弃去上清，加入培养基混匀后于37℃、5% CO2培养箱内进行培养。第2组采用改良复苏方法：立即将冻存管置于42℃水浴快速融化，加入等量10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，800 r·min-1离心5min，弃去上清，加入培养基混匀后于37℃、5% CO2培养箱内进行培养。两组均静置12 h后，更换培养基继续培养。

复苏细胞形态学观察

培养24h后行瑞士染色，光学显微镜下观察细胞的形态及其生长状况。

台盼蓝染色法判断A549细胞存活率

细胞培养12h后用台盼蓝染液计数，每个标本计数 500个细胞，计数3次取平均值。在显微镜下观察，死细胞被染成深蓝色；活细胞边缘光滑且胞体透明、染色很淡。计数3个不重叠视野的未蓝染细胞数，计算细胞的平均存活率。

图1

绘制细胞生长曲线

分别取复苏后的细胞，调整浓度为6×106·mL-1接种培养。以h为横坐标，以细胞浓度为纵坐标绘制出生长曲线，比较不同浓度二甲基亚砜冻存细胞，及不同复苏方法的差异。

结果

A549细胞复苏形态学观察

倒置显微镜下：浓度为5%、10%、15%的DMSO冻存细胞复苏后贴壁状态较好，形态较冻存之前无明显变化或有多角形；20%浓度DMSO细胞生长较慢，可为多角形。两种复苏方法比较，改良复苏方法细胞形态较好。

台盼蓝拒染法判断A549细胞的存活率

5%、10%、15%、20%、DMSO的冻存A549细胞的复苏存活率分别为（87.60±1.26）%、（88.07±2.07）%、（87.17±1.31）%、（42.53±1.10）%；t=2.920，p＜0.05，分别组间比较5%、10%、15%二甲基亚砜组冻存A549 细胞复苏率与 20%二甲基亚砜组， 差异显著（t=1.49～78.32，P均 ＜ 0.05）。传统复苏方法与改良复苏方法细胞存活率分别为（88.07±2.07）%、（90.67±1.48）%；t=2.920，p＜0.05。组间比较无显著差异（t=2.69，p＞0.05）.

A549细胞的生长曲线

不同浓度DOMS冻存液（图1a）

由图可看出5%、10%、15%二甲基亚砜浓度冻存细胞较快达到对数生长期。20%浓度冻存细胞生长缓慢，对细胞损害较大。

不同复苏方法（图1b）

如图可见两种复苏方法无显著差异。

讨论

细胞体外培养冻存复苏以后的生长状态会对许多生物学试验的效果产生直接影响，而其冻存复苏后的生长状态则主要与冻存保护剂的种类、浓度和细胞冻存与复苏的方法条件及培养基血清浓度等有关。细胞冻存在低温环境下，其活力代谢与生化反应基本保持静止状态，故冷冻保存时间的长短对细胞影响较小或无明显影响。所用冻存液种类、浓度及降温的速率是冻存细胞取得良好效果的关键。

本研究选用不同DMSO浓度的冻存保护液冻存A549细胞。结果显示 5%、10% 和 15%组DMSO保存效果最佳明显优于20%组， 且10%组优于 5% 和 15%组，但无明显差异；当 DMSO增至 20%浓度时，细胞的复苏率下降明显。细胞冻存时向培养基中加入保护剂——终浓度5%～15%的甘油或二甲基亚砜，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤，故应用10%浓度的DMSO冻存A549细胞较好。

复苏细胞原则为越快越好，在进行细胞复苏时，传统的方法是37℃水浴融化后离心培养，改良的复苏方法是42℃水浴中溶解，37℃水浴至融化后离心培养。本实验中改良后细胞生长情况与传统复苏方法无显著差异。

细胞培养技术不仅仅是本试验中所涉及到的几点，还受诸如培养的温度、湿度、CO2浓度等多个条件和因素的影响。若能协调好众多的影响因素，尽可能降低细胞损伤，进一步改善细胞复苏与冻存技术，保证细胞活力， 可以随时提供生长状态良好的细胞，以便更有效地促进A549细胞在药物敏感性研究、肺癌发病机制、信号转导机制及诱导分化、药物治疗诱导肺癌细胞凋亡及评价细胞毒试验等方面的广泛应用。

基金项目：吉林省教育厅科学技术研究项目（No.2012489；No.2012338）；2013年吉林省大学生创新创业训练项目

DOI：10.3969/j.issn.1001- 8972.2016.13.027