PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白在宫颈癌细胞株中的表达及意义

宁　超， 荣小灵， 杜　靖

(新疆医科大学1基础医学院生理学教研室， 乌鲁木齐　830011； 2第二附属医院检验科， 乌鲁木齐　830064；3高职学院机能教研室， 乌鲁木齐　830011)



·民族肿瘤学·

PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白在宫颈癌细胞株中的表达及意义

宁超1， 荣小灵2， 杜靖3

(新疆医科大学1基础医学院生理学教研室， 乌鲁木齐830011；2第二附属医院检验科， 乌鲁木齐830064；3高职学院机能教研室， 乌鲁木齐830011)

摘要：目的研究体外特定细胞株(C33a、HaCaT及SiHa)中磷酸肌醇3激酶(PI3K)、细胞外调节激酶(ERK)、胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)和雌激素受体(ER)蛋白的表达量，分析各蛋白的表达与HPV16感染致癌的关系。 方法培养C33a、HaCaT及SiHa 3种细胞，采用蛋白免疫印迹(Western blot)技术检测IGF-1R、PI3K、ERK和ER蛋白在3种细胞株中的表达水平。结果IGF-1R、PI3K和ERK蛋白在SiHa细胞株中的表达高于在C33a、HaCaT细胞株中的表达，差异有统计学意义(P<0.05)，而在SiHa细胞株中ER的表达低于在C33a细胞株中的表达，差异有统计学意义(P<0.05)。结论PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白在宫颈癌细胞株中呈现不同程度的表达,可能与HPV16感染后宫颈癌变存在一定的关系。

关键词：宫颈癌细胞； PI3K； ERK； IGF-1R； ER

宫颈癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，且发病年龄日益年轻化。新疆地区宫颈癌的发病率和病死率一直居全国首位，南疆维吾尔族妇女宫颈癌患病率在全国少数民族中居第1位，被列为新疆特高发肿瘤之一[1-2]。目前认为人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染是导致宫颈癌发生的主要原因之一。肿瘤的发生需多因素协同作用，胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)、雌激素受体(ER)、磷酸肌醇3激酶(PI3K)和细胞外调节激酶(ERK)可促进细胞增殖、分化、存活、黏附和迁移，参与抗肿瘤细胞凋亡[3-5]，并相互影响。然而PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表达与HPV16感染与宫颈癌发生、发展是否存在关联少有报道。本研究分别检测HPV16阴性的子宫颈癌C33a细胞株、永生性人类角质细胞HaCaT细胞株中和HPV16阳性的子宫颈癌SiHa细胞株中PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表达水平，探讨4种蛋白的关系，从分子水平为宫颈癌发病机制提供理论依据。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器HPV16阴性的子宫颈癌C33a细胞株、永生性人类角质细胞HaCaT细胞株和HPV16阳性的子宫颈癌 SiHa细胞株均购自上海细胞库，兔源ERK(ERK1)抗体(1∶1 000)、兔源IGF-1R抗体(1∶500)、兔源ER(ER-α)抗体(1∶1 000)均购自美国abcam公司，兔源PI3K(PI3Kp85)抗体(1∶600)、β-actin多克隆兔抗(1∶1 000)均购自美国SANTA公司。DMEM培养基、胰酶(Biosharp，中国)，双抗/青链霉素合剂(Gibco，美国)，TBST(北京中杉金桥生物技术有限公司，中国)，5%CO2孵育箱(HeraCell-150，Thermo Fishers公司)，生物安全柜(ThermoKS-18，Thermo Fishers公司)，倒置相差显微镜(OLYMPUS，日本)。

1.2方法

1.2.1C33a、HaCaT及SiHa细胞培养配制含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL链霉素，DMEM全培养基，将细胞置于含5% CO2、37℃条件下进行培养，每隔1～2天更换培养基，当培养瓶内细胞整合度达80%时，采用胰蛋白酶(0.25%)消化方法，按1∶2或1∶3比例传代培养。倒置显微镜下观察细胞形态。

1.2.2Western blot检测PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表达将C33a、HaCaT及SiHa细胞分别收集到相应的EP管中，提取蛋白并分装置-80℃冰箱储存备用。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，取50 μg蛋白经8%SDS-PAGE凝胶分离，4℃电泳并转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭3 h，TBST洗膜，加入PI3K、ER、ERK和IGF-1R抗体，室温孵育1 h，转至4℃摇床孵育过夜，TBST洗膜后，加入二抗，室温避光孵育2 h，显色液显色，将PVDF膜上的条带利用凝胶成像处理系统进行灰度扫描，结果采用Quantity one 凝胶分析软件进行分析，计算目的蛋白和β-actin的光密度比值，实验重复3次。

2结果

2.1PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表达Western Blot结果PI3K、ERK和IGF-1R蛋白在SiHa细胞株中的表达量高于在C33a及HaCaT细胞株中的表达，差异有统计学意义(P<0.05)，与SiHa和HaCaT细胞株比较，ER在C33a细胞株中表达增高，差异有统计学意义(P<0.05)(图1)。

1：HaCaT细胞株；2：SiHa细胞株；3：C33a细胞株

2.2C33a、HaCaT及SiHa细胞株中PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表达方差齐性检验显示，FPI3K=3.179，P=0.113；FERK=0.230，P=0.801；FIGF-1R=3.886，P=0.083；FER=0.046，P=0.955，表明方差齐，可用单因素方差分析和LSD-t进行组间比较。PI3K、ERK和IGF-1R蛋白在SiHa细胞株中表达量高于在C33a及HaCaT细胞株中的表达，差异有统计学意义(P<0.05)，与SiHa细胞株比较，ER在C33a细胞株中表达增高，差异有统计学意义(P<0.05)(表1、图2)。

表1　C33a、HaCaT及SiHa细胞株中PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表达

注：与C33a细胞株比较，*P<0.05； 与HaCaT细胞株比较，△P<0.05。

注：与C33a细胞株比较，*P<0.05; 与HaCaT细胞株比较，△P<0.05。

图2C33a、HaCaT及SiHa细胞株中PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表达

3讨论

HPV感染是导致宫颈癌的主要原因之一，机体内一系列细胞生长增殖信号表达异常，都有可能引起细胞正常的转录表达调控发生异常改变。本研究通过测定体外特定细胞株中PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白的表达量，分析各蛋白与HPV16感染致癌的关系，结果发现PI3K、ERK和IGF-1R在SiHa细胞株中高表达，与C33a、HaCaT细胞株中表达量比较，差异有统计学意义(P<0.05)，提示4种蛋白不同程度的表达可能与HPV感染后致癌作用有关。PI3K是细胞内重要的信号传导分子，参与调节细胞的增殖、凋亡与分化等生理过程，多种肿瘤及癌前病变发现PI3K基因突变是肿瘤发生、发展的主要特征。ERK和其信号途径在肿瘤侵袭和转移过程中起中介和信号放大作用[6]，研究表明ERK信号转导通路参与了Ras基因突变引发的宫颈癌细胞增殖[7]。IGF-1R已被证实其具有促进细胞有丝分裂、转移和抑制凋亡的作用，是重要的促肿瘤生长因子，其表达上调可以促进癌细胞的生长，与肿瘤的发生、发展密切相关[8-9]。人体中最主要的雌激素17β-雌二醇(Estrogen，E2)不仅可以通过调节细胞周期和细胞内Ca2+离子浓度水平而调节宫颈癌Hela细胞的增殖活动[10]，还参与上调HPVE6、E7基因的表达，在HPV感染的宫颈上皮恶性转化过程中起促进作用，增加宫颈癌发生风险[11]。

Harris等[12]利用PIK3CA作为探针，通过荧光原位杂交的方法检测到宫颈癌细胞株C-4I、CaSki和ME-180中PI3K拷贝数显著增加，结合本研究结果，提示PI3K通过信号转导途径能够协助HPV16诱发宫颈肿瘤。ERK信号通路可通过调节相关蛋白合成调控宫颈癌SiHa细胞的行为[13]。当宫颈感染HPV16后，HPV16编码的蛋白介导ERK信号转导通路，增强正常宫颈上皮的癌变率。近年来，有关IGF家族是否增加HPV病毒的易患性及其在HPV病毒持续感染中的作用的研究不断增加。发现IGF-1基因的调控可影响正常上皮组织增生、增加HPV感染后致癌的可能性[14]。研究发现，癌基因能够通过提高IGF-1R基因的活性而发挥致癌作用， IGF-1R基因的高表达成为某些癌基因发挥致癌作用的先决和必备条件[15]。因此，IGF-1R高表达促进了HPV16感染后子宫颈癌变的概率。由此可以推测，PI3K、ERK和IGF-1R蛋白表达量升高与HPV16感染过程可能存在协同关系。

张晓波等[16]研究显示高危型人乳头瘤病毒(High-Risk HPV、HR-HPV)感染是诱发宫颈癌的首要启动因素，ER在HPV感染引起的宫颈癌早期起促进作用。王立群等[17]研究结果显示，在子宫肌瘤细胞中ER和IGF-1R的表达明显高于子宫肌层细胞的表达。说明子宫肌瘤的生长与子宫肌瘤组织ER和IGF-1R的表达增强有关。本研究发现，IGF-1R和ER在SiHa细胞株中的表达高于在HaCaT细胞株中的表达(P<0.05)，提示IGF-1R和ER在HPV16感染宫颈癌发生机制中可能具有协同作用。IGR-1R活化后通过Ras/MEK/ERK信号通路启动级联系统，不仅刺激细胞增生、分化以及存活，还可通过PI3K/Akt/mTOR信号通路刺激细胞运动、抗凋亡、促细胞增殖[18]。本实验结果显示PI3K、ERK、IGF-1R在SiHa细胞株中高表达，在HaCaT细胞株中低表达(P<0.05)，与上述文献结果一致，提示PI3K、ERK和IGF-1R蛋白高表达可能促进了HPV16感染后的宫颈细胞癌变。同时本研究观察到C33a细胞株中ER高表达，而PI3K、ERK、IGF-1R 3种蛋白表达量并不高，提示ER并非是在感染HPV的前提下导致宫颈癌发生的单一因素，可能是PI3K、ERK、IGF-1R和ER 4种蛋白与HPV的共同作用促使宫颈癌的发生和发展。

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(本文编辑杨晨晨)

基金项目：新疆维吾尔自治区高校科研计划项目(XJEDU2012I24)

作者简介：宁超(1990-)，女，在读硕士，研究方向：妇科肿瘤。 通信作者：杜靖，女，硕士，副教授，硕士生导师，研究方向：妇科肿瘤，E-mail:598733481@qq.com。

中图分类号：R737.33

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)08-1044-04

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.08.027

[收稿日期：2016-05-16]

The expression of PI3K, ERK, IGF-1R and ER protein in cervical carcinoma cell lines

NING Chao1, RONG Xiaoling2, DU Jing3

(1DepartmentofPreclinicalMedicineCollege,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2DepartmentofClinicalLaboratory,theSecondAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830064,China;3DepartmentofMedicalPhysiology&Biochemistry,HigherVocationalCollege,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of PhosPhoinositide 3 kinase (PI3K), extracellular regulated protein coyness(ERK), Insulin-like Growth Factor 1 Receptor (IGF-1R) and Estrogen receptor (ER) in the specific cervical carcinoma cell lines, and to clarify the relationship between the expression of four proteins and HPV16 in the development of cervical carcinoma. MethodsThe Western blotting was used to detect the substances expression level of IGF-1R, PI3K, ERK and ER proteins in C33a, HaCaT and SiHa. ResultsThe exprssion of IGF-1R, PI3K and ERK in SiHa cell were significantly higher than that in C33a, HaCaT (P<0.05), and the exprssion of ER in the SiHa cell was significantly down-regulated compared with C33a (P<0.05). ConclusionThe differences of protein expression levels in PI3K, ERK , IGF-1R and ER suggested that those maybe associate with the infection of HPV16 in the occurrence of cervical cancer.

Keywords：cervical cancer cells; PI3K; ERK; IGF-1R; ER