中国新疆回族人群9种稀有血型系统基因频率调查研究
2016-07-27林国跃单金晶张雅楠张玉强杜小璐韦潇睿
林国跃, 单金晶, 张雅楠, 张玉强, 杜小璐, 韦潇睿
(解放军第474医院输血科, 乌鲁木齐 830013)
中国新疆回族人群9种稀有血型系统基因频率调查研究
林国跃, 单金晶, 张雅楠, 张玉强, 杜小璐, 韦潇睿
(解放军第474医院输血科, 乌鲁木齐830013)
摘要:目的探讨中国新疆回族人群红细胞MNS、Duffy、Kell、Dombrock、Diego、Kidd、Scianna、Colton和Lutheran血型系统基因频率的分布情况,为人类群体遗传学、临床用血或自身输血及稀有血型库建设奠定基础。方法采用PCR-SSP法对220名新疆回族人群9个血型系统进行基因分型和统计学分析。结果(1)新疆回族人群9种稀有血型系统基因型分布的观测值与期望值基本符合Hardy-Weinberg遗传规则,但MNS和Kidd系统差别有统计学意义(P<0.05)。回族人群有3个稀有血型系统基因表现型罕见存在,即S-s- 2例,频率为0.009 0;Jka-b-6例,频率为0.027 2;Fya-b-1例,频率为0.004 5。(2)中国新疆回族人群9个血型系统等位基因频率分别为M=0.520 4,N=0.479 6,S=0.095 4,s=0.904 6,Fya=0.872 7,Fyb=0.127 3,K1=0.006 8,K2=0.993 2,Doa=0.138 6,Dob=0.861 4,Dia=0.015 9,Dib= 0.984 1,JKa=0.495 5,JKb=0.504 5,Sc1=1.000 0,Sc2=0,Coa=0.993 2,Cob=0.006 8,Lua=0,Lub=1.000 0,Aua=0.909 1,Aub=0.090 9。结论中国新疆回族人群MNS、Kidd、Duffy、Dombrock和Diego 5种血型系统基因频率分布与其他种族有明显区别,呈现多态性;MNs和Kidd血型系统发生遗传改变,具有民族自身独特性;Kell和Colton基因分布与藏族、汉族其他人群分布相似;Scianna、Kell和Lutheran与藏族、汉族其他人群分布特点相同,呈单态性分布特征。
关键词:稀有血型; 基因型; 基因频率; PCR-SSP; 回族; 新疆
当一个人的某种血型抗原在人群中出现的频率小于1‰时,称为稀有血型。稀有血型者最大的问题是当需要治疗时找不到相同的血液,紧急抢救的患者可危及生命安全,因此临床非常重要。许志远等[1]报道血型系统基因频率在不同人种、民族和地区中的分布有差异。准确地鉴定稀有血型,了解其基因频率分布情况,可以避免临床免疫性输血反应,使临床用血治疗更加科学合理、效果更好[2]。目前,国际输血协会(ISBT)正式命名的人类红细胞血型系统已有33个,包括300多个可遗传的人类红细胞血型抗原[3]。新疆民族众多,世居的就有13个民族之多,北疆主要为维吾尔族、哈萨克族、回族、汉族,居住环境相对封闭隔离、通婚、人群迁徙等因素使得稀有血型分布存在多态性,可能具有独特的遗传特征;国内对回族人群的稀有血型研究甚少。为探讨新疆回族人群红细胞MNS、Duffy、Kell、Dombrock、Diego、Kidd、Scianna、Colton和Lutheran血型系统基因频率分布情况,本研究采用分子生物学方法对新疆220人份无血缘关系的回族人群进行研究,旨在为人类群体遗传学、临床用血或自身输血及西部边疆稀有血型库建设奠定基础。
1材料与方法
1.1研究对象及标本来源于2015年2-10月抽取在解放军第474医院回族3代以内无血缘关系的人群血样220人份,其中男性106人,女性114人,年龄1~85岁(中位数年龄46.7岁)。ABO血型中,A型48例,B型70例,O型91例,AB型11例,Rh(D)阳性216例、Rh(D)阴性4例。EDTA抗凝,采集静脉血3~5 mL/(人)份,应用德国PROTRANS产品全血基因组DNA快速提取试剂盒操作,于-20℃保存。
1.2主要试剂与仪器
1.2.1试剂人类红细胞MNS、Duffy、Kell、Dombrock、Diego、Kidd、Scianna、Colton和Lutheran血型系统基因分型试剂盒(PCR-SSP法)(由天津秀鹏生物技术有限公司合成,所有试剂均在有效期内),全血基因组DNA提取试剂盒(批号12F01,德国PROTRANS产品)和琼脂糖(批号111860,BIOWEST Spain基因有限公司产品)均由北京圣泰华生物技术有限公司提供,Taq聚合酶(美国Promega公司生产,规格:5 U/μL),电泳染色剂、溴化乙锭(EB)10 mg/mL要求分析纯,1×TBE溶液及各组分要求分析纯,纯化水为去离子水。
1.2.2仪器生物安全柜(Haier公司生产),TG16-W微量高速离心机(湘仪离心机),HC-2515高速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司生产),DYY-BC型电泳仪、电泳槽和WD-9413B凝胶成像分析仪均由北京市六一仪器厂生产,BIO-RAD PCR仪(型号,580BR 6679,美国生产),PET连续微量移液器(5~100 μL),涡旋混匀器,美的牌微波炉,可加热液体到100℃。
1.3基因组DNA提取DNA提取方法均严格按照德国快速提取试剂盒说明书操作完成;用紫外分光光度计测定所得基因组DNA浓度及纯度,浓度过高的样本用缓冲液TE稀释,将DNA溶液终浓度控制在30~120 ng/μL,最佳浓度为30~50 ng/μL,260/280纯度比值为1.60~1.90。基因组DNA样本-20℃以下保存备用,集中统一分批检测、记录。
1.49种稀有血型系统红细胞基因分型
1.4.1PCR-SSP法扩增血型基因DNA分子根据Genebank公布的基因序列,PCR-SSP引物设计通过针对红细胞MNS、Duffy、Kell、Dombrock、Diego、Kidd、Scianna、Colton和Lutheran共9种血型系统基因不同碱基的替换或缺失设计特异性引物(表1)。即根据基因在外显子或内含子不同的特异性碱基替换,设计该特异性碱基为正义链引物的3′末端,由于Taq酶缺乏3′-5′外切酶活性,与引物3′末端不相配的等位基因模板不能进行扩增,而与引物3′末端相配的等位基因顺利扩增。内参质控品为人类生长激素基因(HGH)的保守片段设计内参引物,存在于每个引物孔中,且在每次试验中运行。因其存在于所有人类的DNA样本中,该扩增产物可在所有有效试验中被电泳检出。
1.4.2扩增步骤首先提取样本DNA,浓度50 ng/μL最佳;反应条件:按要求设定PCR仪循环参数,96℃ 2 min 1个循环;96℃ 20 s,68℃ 60 s,5个循环;96℃ 20 s,65℃ 45 s,72℃ 30 s 10个循环;96℃ 20 s,62℃ 45 s,72℃ 30 s 15个循环;72℃ 3 min 1个循环;4℃保存。反应体系:按比例配制dNTP-Buffer工作液1 000 μL[440 μL浓缩dNTP-Buffer+560 μL无菌水(PCR级)],混匀并离心,按比例配制Buffer-酶-样本混合液,每人份用量:220 μL dNTP-Buffer工作液+1.7 μL Taq酶(5 units/μL)+25 μL样本DNA=246.7 μL混合液,混匀并离心。每孔(1~22孔)各加入10 μL混合液、15~20 μL石蜡油,盖好反应管;将引物板放入已经设置好参数的PCR仪内,并启动PCR程序扩增,直到循环结束。制备2.5%琼脂糖凝胶。
1.4.3电泳按照一定的顺序,每孔取5~10 μL PCR反应产物转移到已经准备好的凝胶系孔中,记好加样顺序,加用0.5×TBE缓冲液约100 mL,设定电压150 V、电流110 mA电泳12 min,内参带和阳性带清晰分开即可停止电泳;用凝胶成像系统拍摄实验结果并保存记录图像。
表1 MNS和Duffy等稀有血型系统基因分型时碱基对、核苷酸突变位点及引物
1.4.4实验结果判断分析PCR-SSP法为定性实验,检测的特异性扩增带强弱不影响结果判读,内参质控品为每孔含有429 bp的人类生长激素保守片段作对照,阴性孔应该出现,阳性孔内参质控带可能会很弱或不出现,但不影响结果判断。判断标准:内参带和特异性扩增带同时出现,判断为阳性;只有内参带而无特异性扩增带,判断为阴性;内参带和特异性扩增带均没有出现,判断为实验失败,需重新检测。
1.5统计学处理采用SPSS12.0软件进行数据分析,计算回族人群基因频率,某基因频率=某基因的纯合子频率+1/2杂合子频率;基因型频率=AA基因型的个体数/该二倍体群体总数。采用χ2检验,比较基因型分布资料的观察值与期望值,比较基因频率分布的差异,分析是否符合Hardy-Weinberg遗传法则;χ2公式=(观察数-期望数)2/期望数,P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1新疆回族人群9种稀有血型系统基因分型其表现型频率分布情况新疆回族人群9种稀有血型系统基因型分布的观测值与期望值基本符合Hardy-Weinberg遗传规则,但MNS和Kidd系统差别有统计学意义(P<0.05),回族人群有3个稀有血型系统基因表现型罕见存在,即S-s-2例,频率为0.009 0;Jka-b-6例,频率为0.027 2;Fya-b-1例,频率为0.004 5,未见文献报道,见表2。
表2 新疆回族人群9种稀有血型系统基因分型其表现型频率分布情况(n=220)
2.2新疆地区回族人群9种稀有血型系统基因型频率和等位基因频率分布中国新疆回族人群红细胞9种稀有血型系统等位基因频率分别为M=0.520 4,N=0.479 6,S=0.095 4,s=0.904 6,Fya=0.872 7,Fyb=0.127 3,K1=0.006 8,K2=0.993 2,Doa=0.138 6,Dob=0.861 4,Dia=0.015 9,Dib=0.984 1,JKa=0.495 5,JKb=0.504 5,Sc1=1.000 0,Sc2=0,Coa=0.993 2,Cob=0.006 8,Lua=0,Lub=1.000 0,Aua=0.909 1,Aub=0.090 9,见表3。
2.3某例回族人9种稀有血型等位基因电泳结果某例回族人9种稀有血型电泳结果显示MNS、Duffy、Kell、Dombrock、Diego、Kidd、Scianna、Colton、Lutheran血型系统基因型分别为M+N+、S-s+、Fya+b+、K1-2+、Doa-b+、Dia-b+、Jka+b+、Sc1+2-、Coa+b-、Lua-b+、Aua-b+,其阳性条带、阴性条带、质控参比带清晰分明,结果很易判读,见图1。
3讨论
本研究结果显示,新疆回族人群MNS血型系统中,M等位基因频率为0.520 4,与汉族人群基本一致[4-9],但M又明显低于西藏藏族人群(0.680 9),维吾尔族人群(0.579 1)(我们已有研究结果,《中国组织工程杂志》待发表);N等位基因频率为0.479 6,与汉族基本相同,但明显高于西藏藏族(0.319 1)和新疆维吾尔族(0.420 9)。S和s基因频率国内汉族报道较少,本研究结果显示,新疆回族S频率>0.095 4,明显低于西藏藏族(0.146 7)和新疆维吾尔族(0.174 3),又高于四川成都汉族(0.037 6)[4,9];基因型SS 1例、ss 181例、Ss 36例,且发现存在表现型S-s-2例,频率为0.009 0,十分罕见,未见文献报道。这些结果说明新疆回族人群MNS血型系统等位基因频率有其自身分布特点、具有民族特异性。
表3新疆地区回族人群9种稀有血型系统基因型频率和等位基因频率分布
血型系统基因型频数基因型频率等位基因等位基因频率MNSMM450.2045M0.5204NN360.1636N0.4796MN1390.6318SS10.0045S0.0954ss1810.8227s0.9046Ss360.1636DuffyFya/Fya1660.7545Fya0.8727Fyb/Fyb30.0136Fyb0.1273Fya/Fyb500.2273KellK1/K100K10.0068K2/K22170.9864K20.9932K1/K230.0136DombrockDoa/Doa40.0182Doa0.1386Dob/Dob1630.7409Dob0.8614Doa/Dob530.2409DiegoDia/Dia00Dia0.0159Dib/Dib2130.9682Dib0.9841Dia/Dib70.0318KiddJKa/JKa490.2227JKa0.4955JKb/JKb570.2591JKb0.5045JKa/JKb1080.4909SciannaSc1/Sc12201.0000Sc11.0000Sc2/Sc200Sc20Sc1/Sc200ColtonCoa/Coa2170.9864Coa0.9932Cob/Cob00Cob0.0068Coa/Cob30.0136LutheranLua/Lua00Lua0Lub/Lub2201.0000Lub1.0000Lua/Lub00Aua/Aua1800.8182Aua0.9091Aub/Aub00Aub0.0909Aua/Aub400.1818
Duffy血型系统发现于1950年,现研究认为,中国、日本、朝鲜等地区Fya 基因频率>0.970 0,白种人群Fya频率<0.660 0,非洲黑人为0.100 0,中非共和国黑人Fya基因频率为0,该地区均为Fya-b-型,其在白种人和亚洲人中极为罕见。本研究结果显示Duffy血型系统基因频率Fya为0.872 7,较西藏藏族(0.921 8)[4]、江苏汉族[10]、洛阳汉族[11]、浙江汉族[12]、上海汉族[13]等明显低,但高于新疆维吾尔族人群(0.699 4)。本研究发现Fya-b-1例,频率为0.004 5,回族尚未研究报道。由此认为该系统的基因频率在我国地理分布上未见有规律性,却存在不同人种的差异性;提示在临床选择该类血液时,紧急情况的患者用血常发生困难,需扩大回族人群采血范围,加大检测力度,并提前做好血型筛选工作,防患未然。
图1 某例回族人9种稀有血型等位基因电泳结果
国外研究表明,Dombrock血型系统中Doa阳性在白人中为67%,黑人为55%,日本人为24%,泰国人为0.140 0[14]。本研究结果显示回族人群基因频率Doa为0.138 6,与Wu等[15]报道的新疆回族人群的0.255 9低,但明显高于四川成都汉族[9]、上海汉族[13]、西安汉族[16],低于西藏藏族(0.150 4)、新疆维吾尔族(0.255 9),说明不同地区的人群有很大的不同,且存在民族差异。
本研究结果显示新疆回族人群Diego血型系统基因频率Dia为0.015 9,明显低于西藏藏族[4]、四川成都汉族[9]、西安汉族[16]、江西汉族[17]、四川彝族[18],这在临床输血上有重要意义。研究认为,中国人群中Dia抗原阳性达9%,由抗Dia抗体引起溶血性输血反应和新生儿溶血病[19]。此外,Dia主要分布在蒙古人群中,具有重要的人类学意义[20]。
Kidd血型分布具有民族特异性。白种人群和黑种人群中Jka基因频率略高[18],而中国汉族人群中Jkb频率略高于Jka[21-23]。本组回族人群Jka与Jkb基因频率分别为0.495 5和0.504 5,二者非常接近,Jka低于Jkb,符合东方人群一般Jkb高于Jka的特点,说明回族人群接近汉族人群,其遗传迁徙与汉族人种有关联;但其Jka较西藏藏族[4]、新疆维吾尔族[24]、浙江畲族[25]明显低,这在民族起源、迁徙、临床输血中有重要意义。亚洲人群Jka-b-表现型基因频率低于0.01%,高加索人、印地安人及波利维亚人中Jka-b-表现型频率较高[22]。Jka-b-曾中国澳门血液中心被发现[19],用血清学方法一般很难发现罕见的个体[26],严康峰[27]在50 034例供血者中筛选出10例Jka-b-,频率为0.000 2。而西藏藏族人群未发现Jka-b-个体[4]。本研究在新疆回族人群中发现6例Jka-b-,频率为0.027 2,高于亚洲人群0.01%比例,在临床输血中,应选择、调配合适的血型血液或自身输血,做好此类稀有血型的筛选鉴定工作。
本研究采用χ2检验比较9种稀有血型系统基因型其表现型分布的观察值与期望值,除MNS和Kidd系统差别有统计学意义外(P<0.05),基本符合Hardy-Weinberg遗传法则。但是也存在变异,说明新疆回族地区人群因居住环境改变、隔离、各民族间的通婚及历史上人群迁徙等因素影响,使稀有血型种群部分基因发生改变,使稀有血型分布具有自己的遗传特征。因为理论上对于一个种群来说,理想状态下种群基因频率在世代相传中保持稳定,然而在自然条件下却受基因突变、基因重组、自然选择、迁移和遗传漂变的影响,种群基因频率处于不断变化之中,使生物不断向前发展进化。
新疆回族人群Kell和Colton基因频率分布与张嵘等[4]报道的藏族、汉族其他人群分布相似,且Scianna、Kell和Lutheran呈单态性分布特点。
总之,新疆回族人群MNS、Duffy、Kidd、Dombrock和Diego血型系统频率分布与其他种族明显不同,具有独特民族分布特点;与报道的藏族、汉族等其他人群频率分布有相似点,也有差别点,具有多态性。本研究成果对了解新疆回族人群稀有血型遗传背景、民族迁徙情况、临床用血指导及新疆少数民族稀有血型库的建设提供了宝贵数据资料,奠定了研究基础。
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(本文编辑王艳)
基金项目:兰州军区医药卫生科研计划项目(CLZ15JB26)
作者简介:林国跃(1962-),男,硕士,主任技师,硕士生导师,研究方向:临床输血治疗、移植免疫及基因组织配型研究,E-mail:lgy474@163.com。
中图分类号:R457.1+.1
文献标识码:A
文章编号:1009-5551(2016)08-1026-06
doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.08.022
[收稿日期:2015-11-26]
Distribution of gene frequencies of 9 kinds of rare blood group system in Hui nationalities in Xinjiang, China
LIN Guoyue, SHAN Jinjing, ZHANG Yanan, ZHANG Yuqiang, DU Xiaolu, WEI Xiaorui
(DepartmentofBloodTransfusion,People′sLiberationArmy474Hospital,Urumqi830013,China)
Abstract:ObjectiveTo investigate RBC MNS, Duffy, Kell, Dombrock, Diego, Kidd, Scianna, Colton and Lutheran blood group gene frequency distribution in Hui nationalities in Xinjiang and build the basis for human population genetics, clinical use of blood or blood autotransfusion and rare library. MethodsNine blood group genotyping of 220 Muslim cases in Xinjiang were detected by PCR-SSP method and statistical analyzed. ResultsGenotypes observations values and expectations values were obeyed the Hardy-Weinberg genetic rules, but MNS and Kidd systems difference was statistically significant (P<0.05). It was found that there were three rare blood group gene phenotypes in Hui nationalities which were S-s- 2 cases, frequency of 0.009 0; Jka-b-6 cases, frequency of 0.027 2; Fya-b-1 case, frequency of 0.004 5.Those were not been reported. nine blood group systems allele frequencies in Hui nationalities in Xinjiang were M=0.0.520 4, N=0.479 6, S=0.095 4, s=0.904 6, Fya=0.872 7, Fyb=0.127 3, K1=0.006 8, K2=0.993 2, Doa=0.138 6, Dob=0.861 4, Dia=0.015 9, Dib=0.984 1, JKa=0.495 5, JKb=0.504 5, Sc1=1.000 0, Sc2=0, Coa=0.993 2, Cob=0.006 8, Lua=0, Lub=1.000 0, Aua=0.909 1, Aub=0.090 9. ConclusionMNS, Kidd, Duffy, Dombrock and Diego 5 cases blood group gene frequency distribution systems had obvious difference in Xinjiang Hui nationalities comparing with other races. Genetic alterations occured in MNs and Kidd blood group systems,which had there own unique characters; Kell and Colton gene distribution in Xinjiang Hui nationalities were similar to thoes in Tibetan and Han;The distribution of Scianna, Kell and Lutheran were similar to Tibetan, Han, and their distributions showed a single state.
Keywords:rare blood; genotype; gene frequency; PCR-SSP; Hui; Xinjiang
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