毛细管区带电泳法分析药桑多糖中单糖的组成

张　晖， 宋峰峰， 谢　睆， 李松雅， 马晓丽

(1新疆生产建设兵团第六师奇台医院药剂科， 新疆　奇台　831800； 新疆医科大学2药学院； 3分析测试中心， 乌鲁木齐　830011)



毛细管区带电泳法分析药桑多糖中单糖的组成

张晖1， 宋峰峰2， 谢睆2， 李松雅2， 马晓丽3

(1新疆生产建设兵团第六师奇台医院药剂科， 新疆奇台831800； 新疆医科大学2药学院；3分析测试中心， 乌鲁木齐830011)

摘要：目的了解高效毛细管区带电泳法分析药桑多糖中单糖组成的作用。方法将药桑多糖经酸水解后,经1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化,采用高效毛细管电泳法分析各单糖组成。电泳条件：180 mmol/L 硼酸缓冲液溶液，pH=10.05,柱温25℃,电压15 kV,气压进样3. 447 5 kPa下进样10 s,检测波长245 nm。结果药桑多糖中主要由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸组成,其物质的量之比为1∶7.4∶15.8∶3.4∶10.8∶14.3∶4.5。结论高效毛细管电泳法用于多糖中单糖的组成分析具有快速、简便、精度高的特点，可用于药桑多糖中单糖组成测定和质量控制。

关键词：高效毛细管电泳; 药桑多糖; 单糖组成

药桑属黑桑种(Morus nigra Linn) ，为天然22倍体半栽培类型野生桑树种质资源[1]，仅分布于新疆阿克苏、和田和喀什地区，是新疆独特的药用果桑种质资源，药桑为维吾尔族重要的民间药材，维吾尔族称其为“夏图土”[2-5]，具有健脑安神、益脾胃、补血养肝的作用，用于治疗心悸失眠、健忘、脾胃虚寒和黄疸肝炎等疾病[6]。对药桑组分研究的相关报道较多[7-10]，目前主要集中在药理学和药效学研究，未见采用高效毛细管电泳法对药桑多糖的单糖组成的分析报道。本研究采用柱前衍生化方法，用毛细管电泳法研究药桑多糖的单糖组成，以期为新疆道地资源药桑的开发和利用提供基础依据。

1仪器与试剂

1.1材料与试剂药桑采自喀什市，由新疆医科大学药学院帕丽达教授鉴定为药桑黑桑种(Morus nigra Linn)的果实。单糖对照品葡萄糖(D-Glucose anhydrous，110833-200904)、甘露糖(Mannose，140651-200602)、半乳糖(Galactose,100226-201105)、鼠李糖(Rhamnose，111683-200401)、半乳糖醛酸(GalUA,111201-200609)、木糖(D-xylose,111508-200404)、阿拉伯糖(Arabinose，1506-200001)均购自中国食品药品鉴定研究院；甲醇、无水乙醇、氯仿、三氟乙酸(天津市富宇精细化工有限公司，分析纯),HCl、NaOH(洛阳市化学试剂厂，分析纯),衍生化试剂：1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)(上海试剂二厂，分析纯),水为超纯水。

1.2仪器P/ACE MDQ型高效毛细管电泳仪(美国 Beckman公司),32 Karat Sofware(美国Benkman公司),未涂层毛细管柱(河北永年县锐沣色谱器件公司,d=75 μm),BS110S型分析天平(北京赛多利斯天平有限公司),phsj-3F型 pH计(上海仪电科学股份有限公司),KQ-500PE型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)DZKW-S-4型水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)。

2方法与结果

2.1药桑多糖的粗提取称取10.0 g药桑粉末至锥形瓶，加入100 mL超纯水，进行超声提取，温度60℃,功率59 kHz，时间30 min,提取1次。抽滤，将滤液转移至烧杯中，随后用旋转蒸发仪进行浓缩至约剩10 mL缩液，转至烧杯，按乙醇-浓缩液=4∶1的比例进行醇沉。室温静置24 h，得到多糖沉淀，弃上清液，将沉淀转移至蒸发皿，放入减压烘箱干燥12 h，即得药桑多糖粗提取物，备用。

2.2药桑多糖的水解精确称取药桑多糖10 mg置于安瓿瓶，加入三氟乙酸2 mL，置于105℃烘箱中，进行酸水解，4 h后得单糖混合试液。将该试液进行旋转蒸发浓缩，用甲醇浓缩3次，每次3 mL,最终用超纯水转移4次，至5 mL容量瓶定容，即得。

2.3衍生化处理

2.3.1单糖混合对照品溶液的配制及衍生化分别精密称取单糖对照品木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸30.0、30.0、36.0、32.8、36.0、36.0、39.2 mg(纯度≥98%)，置于10 mL 容量瓶中，加水溶解并定容，制成浓度均为20 mmol/L 的单糖对照品溶液备用。分别精密吸取1 mL 20 mmol/L的7种单糖对照品溶液于10 mL量瓶中，用超纯水定容，混匀，得到各单糖浓度均为2 mmol/L的单糖混合对照品溶液。取该溶液500 μL于炮弹管，加入PMP甲醇溶液500 μL与0.3 mol/L NaOH溶液500 μL，涡旋30 s,然后置于70℃水浴30 min,冷却至室温，加入0.3 mol/L HCL溶液，涡旋进行中和。再加2 mL氯仿，上下翻转10次，吸取下层液弃去，重复2次，第3次吸取上层液体，过0.45 μm滤膜，进样, 记录图谱。

2.3.2多糖样品衍生化精密吸取药桑多糖酸水解液500 μL，按照“2.3.1”项下衍生化方法对酸水解液进行衍生化， 过0.45 μm 微孔滤膜, 进样, 记录图谱。

2.4电泳条件未涂层毛细管柱(永年县锐沣色谱器件公司，d=75 μm)，缓冲液：180 mmol/L硼酸溶液，pH=10.05，柱温25℃，电压15 kV，压力进样3.447 5 kPa下进样10 s，检测波长245 nm。毛细管电泳仪每次使用之前，依次用水、0.1 mol/L NaOH溶液、水、0.1 mol/L HCl溶液、水、缓冲液各冲洗3 min，再用缓冲液平衡 5 min。通过单糖混合对照品 PMP 衍生物电泳条件的优化 ,最终选择上述分离体系,能得到较理想的分离效果 , 混合对照品及样品的分离图见图1、2 。

1: PMP; 2: 木糖; 3: 阿拉伯糖; 4: 葡萄糖; 5: 鼠李糖; 6: 甘露糖; 7: 半乳糖; 8: 半乳糖醛酸图1　混合单糖对照品的PMP衍生物高效毛细管电泳图

2.5线性关系考察配置浓度为0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、0.75、1、2 mmol/L的混合标品溶液。经“2.3.1”项下衍生化后，按“2.4”项下最终选定的色谱条件分别进样、测定。以对照品浓度X (mmol/L)为横坐标，峰面积Y为纵坐标进行线性回归，得回归方程，相关系数r>0.995 0。实验结果表明:药桑多对照品溶液浓度在0.031 2～2.000 0 mmol/L范围内,线性关系良好。7种单糖的回归方程见表1。

1: PMP; 2: 木糖; 3: 阿拉伯糖; 4: 葡萄糖; 5: 鼠李糖; 6: 甘露糖; 7: 半乳糖; 8: 半乳糖醛酸图2　多糖水解样品PMP衍生物高效毛细管电泳图

表 1　7种单糖线性关系考察结果

2.6重复性实验取同一批药桑样品，按供试品溶液的制备法制备并衍生，进样6次，测定药桑多糖中各单糖峰面积的RSD为1%～6%，表明本方法重复性好，见表2。

表2　重复性试验结果

2.7稳定性试验取“2.6”项下供试品溶液在0、2、4、6、8、12、24、48 h分别进样测定，结果48 h内各单糖色谱峰面积无明显变化， RSD分别为3.76%、1.20%、1.24%、5.34%、3.07%、2.83%、6.62%，表明被测样品在48 h内稳定性良好。

2.8精密度试验取同一对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积。精密度试验符合要求。各个单糖的RSD分别为木糖1.72%、阿拉伯糖1.78%、葡萄糖2.36%、鼠李糖3.80%、甘露糖4.16%、半乳糖3.57%、半乳糖醛酸3.60%。

2.9回收率试验精密吸取2 mmol/L的单糖对照品混合液0.4、0.5、0.6 mL，得低中高3个浓度对照品试液。按“2.1”项下方法制备供试品溶液。用移液枪吸取供试液和高中低对照品试液各250 μL L,各3份，进行衍生。按上述色谱条件进样测定，计算加样回收率，见表3。

表3　回收率测定结果(n=6)

2.10样品分析结果精确称取药桑多糖依“2.2”、“2.3.2”项下方法进行操作，将混合单糖对照品图谱与样品的图谱对照，由迁移时间可知，药桑多糖由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸7种单糖组成，采用校正因子计算单糖组成比例，求得药桑多糖中木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸的物质的量之比为1∶7.4∶15.8∶3.4∶10.8∶14.3∶4.5。

3讨论

3.1多糖提取及衍生本研究使用了超声法和水浴法提取多糖，超声法提取的产率较水浴法高，并且超声法简便，快速，因此选择了超声法提取多糖。除了糖醛酸外，其他中性糖的电离能力非常弱，PMP衍生物电离能力也非常弱，但单糖属于多羟基化合物，能和硼酸根形成带负电荷的络离子，可以选用硼砂液为电泳缓冲液[3]，PMP产生的峰可与各单糖衍生物很好地分离，不影响样品的测定。

3.2电泳条件优化结果电泳缓冲液对分离的影响:实验结果表明，缓冲液的酸度和浓度对分离具有明显的影响。7种单糖对照品PMP衍生物的分离度随硼酸缓冲液pH值增加而提高，同时增加缓冲液中硼砂浓度，分离度提高，但单糖的出峰时间亦有所延长，且电流增加较明显，影响重现性。在本实验

条件下，硼酸浓度为180 mmol/L时分离效果最为理想，7种单糖基本达到基线分离。通过单糖对照品PMP衍生物CZE分离条件的优化，本实验选择硼酸缓冲液浓度180 mmol/L，pH=10.5，电压15 kV，柱温25℃的CZE分离体系，能得到较理想的分离效果。

采用HPCE法测定药桑多糖，与原有的总多糖测定方法相比，有分离效率高，使用简便、快速，供试品需要量少等显著优点。其定性、定量结果不仅为其它糖类化合物提供了有益的启示，而且证明HPCE法具有广阔的应用前景。

参考文献：

[1]买买提依明． 新疆药桑的研究[J].北方蚕业，2007，28(1):1-3.

[2]买买提依明,卢红,木合达尔,等. 新疆药桑的有效成分测定及药理作用的研究初报[J].北方蚕业,2006,27(4):16-18.

[3] 新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所.中华本草·维吾尔药卷[M].上海:上海科学技术出版社，2005：325-326.

[4]吴志平,周巧霞,顾振纶,等. 桑树不同药用部位的降血糖效果比较[J].蚕业科学,2005,31(2):215-217.

[5]宋大可,买买提依明·乃比江. 新疆药桑果汁化学成份及药物价值探讨[J].蚕桑通报，1994，25(4)：23-34.

[6]刘勇民.维吾尔药志[M].乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社,1999:43-47.

[7]夏娜,陈义磊,陶海燕,等.药桑多糖对大鼠肝损伤的保护作用[J].食品科学, 2015,36(13):247-251.

[8]宋峰峰,倪雪雪,魏鸿,等.基于FTIR的药桑主成分分析[J].新疆医科大学学报[J].2014,37(5)：565-567.

[9]王贺,刘健健,杨俊玲,等.新疆药桑不同部位降血糖活性研究[J]. 广州化工,2014,42(14):76-78.

[10]于小蓉,孙莲,孟磊. 新疆药桑叶单糖组成的气相色谱分析 [J].西北药学杂志, 2013,28(1):25-29.

(本文编辑施洋)

基金项目：国家自然科学基金(81460493；81260144)

作者简介：张晖(1994-)，男，本科，药士，研究方向：天然药物分析。 通信作者：马晓丽，女，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：糖尿病新药研究，E-mail: mxl108@sohu.com。

中图分类号：R914

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)08-1017-04

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.08.020

[收稿日期：2015-12-16]

The quantitative determination of monosaccharide compositions in polysaccharide of Morus nigra Linn by High Performance Capillary Zone Electrophoresis

ZHANG Hui1, SONG Fengfeng2, XIE Huan2, LI Songya2, MA Xiaoli3

(1DepartmentofPharmacyQitaiHospital,SixthDivisionofXinjiangProductionandConstructionCorps,XinjiangQitai, 831800,China；2CollegeofPharmacy；3CenterofInstrumentalAnalysis,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011，China)

Abstract:ObjectiveThe High Performance Capillary Zone Electrophoresis was used to analysis monosaccharide composition in polysaccharide of Morus nigra Linn. MethodsThe polysaccharide of Morus nigra Linn were derivatization with 1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP) after hydrolyzed into monosaccharides with Trifluoroacetic Acid (TFA) and were separated by HPCE. The CE condition: Buffer: 180 mmol/L boric acid solution ( pH 10.05), column temperature: 25℃；Voltage: 15kV; injection time: 3.447 5 kPa×10 s, the detection: 245 nm. ResultsThe polysaccharide was mainly composed of xylose, Arabinose, Glucose, Rhamnose, Mannose, Galactose, GalUA. The amount of the substance is 1∶7.4∶15.8∶3.4∶10.8∶14.3∶4.5. ConclusionHigh performance capillary electrophoresis method for the analysis of polysaccharide is rapid, simple and high accuracy. It can be used for the determination and quality control of polysaccharide in Morus nigra Linn.

Keywords：High Performance Capillary Zone Electrophoresis; polysaccharide of Morus nigra Linn; monosaccharide composition