原发性肺癌组织中VEGF、HIF-1α、EGFR的表达及其相关性研究

张　冉， 木合塔江·吐尔逊， 马晓梅

(新疆医科大学附属肿瘤医院病理科， 乌鲁木齐　830011)



原发性肺癌组织中VEGF、HIF-1α、EGFR的表达及其相关性研究

张冉， 木合塔江·吐尔逊， 马晓梅

(新疆医科大学附属肿瘤医院病理科， 乌鲁木齐830011)

摘要：目的探讨原发性肺癌中血管内皮生长因子(VEGF)、低氧诱导因子(HIF-1α)、表皮生长因子受体(EGFR)的表达及其相关性。方法收集新疆医科大学附属肿瘤医院手术切除的63例原发性肺癌和26例肺良性病变标本，采用免疫组织化学方法检测原发性肺癌组织和肺良性病变组织中VEGF、HIF-1α、EGFR的表达。结果原发性肺癌组织中VEGF阳性表达率为68.25%，显著高于肺良性病变组织的20.00%，差异有统计学意义(P<0.001)；原发性肺癌组织中HIF-1α阳性表达率为55.56%，显著高于肺良性病变组织的13.33%，差异有统计学意义(P<0.001)；原发性肺癌组织中EGFR阳性表达率为47.62%，高于肺良性病变组织的13.33%，差异有统计学意义(P=0.001)。原发性肺癌组织中VEGF和HIF-1α的阳性表达呈正相关(r=0.279，P<0.05)；VEGF与EGFR的阳性表达呈正相关(r=0.295，P<0.05)；EGFR与HIF-1α的阳性表达呈正相关(r=0.267，P<0.05)。原发性肺癌组织中VEGF、HIF-1α的阳性表达与淋巴结转移、吸烟史和临床分期相关；EGFR的阳性表达与淋巴结转移和临床分期相关。结论VEGF、HIF-1α、EGFR在原发性肺癌的发生、发展发挥作用，且可能存在协同作用。

关键词：肺癌； VEGF； HIF-1α； EGFR

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内，其总体发病率和死亡率均居恶性肿瘤首位[1]。血管内皮生长因子(VEGF)是迄今发现的功能最强、特异性最高的血管生成调控因子。已有研究表明VEGF及其亚型的表达与肺癌相关，其通过促进肿瘤血管的形成，从而在肿瘤的发生、发展及转移过程中起到重要作用[2]。低氧诱导因子(HIF-1α)是一种受缺氧状态调节的转录因子，已有研究表明HIF-1α与人体大多数恶性肿瘤相关[3]，与肿瘤的形成、侵袭和远处转移有密切关系。表皮生长因子受体(EGFR)是erbB受体家族的一种，属于酪氨酸激酶受体，迄今已在多种恶性肿瘤组织中检测到EGFR的表达。已有研究表明EGFR通过自分泌或旁分泌的形式，在肿瘤的进展和侵袭中发挥重要作用[4]。本研究采用免疫组织化学法检测VEGF、HIF-1α及EGFR在原发性肺癌组织中的表达，分析其与临床病理特征的关系，以了解VEGF、HIF-1α及EGFR的表达在原发性肺癌发生、发展中的作用，为原发性肺癌的病因学研究、预防及临床预后提供一定的参考依据。

1材料与方法

1.1标本来源收集2014年2-12月新疆医科大学附属肿瘤医院手术切除新鲜原发性肺癌标本63例。其中男性45例，女性18例；年龄29～81岁，中位年龄65岁；鳞状细胞癌28例，腺癌24例，小细胞癌11例；有淋巴结转移29例，无淋巴结转移34例；有吸烟史27例，无吸烟史36例；Ⅰ～Ⅱ期43例，Ⅲ～Ⅳ期20例。肺癌的组织学分类、TNM分类及分期分别按照“世界卫生组织肺肿瘤组织学分类”和“国际抗癌联盟制定的恶性肿瘤的TNM分期法”。所有患者术前均未接受过放疗或化疗，并且由至少2位副高职称病理医师进行诊断。另选取本院同期住院的30例新鲜肺良性病变作为对照，其中肺结核8例，炎性病变10例，支气管扩张症8例，细粒棘球蚴病2例，错构瘤2例。

1.2主要试剂鼠抗人HIF-1α单克隆抗体购自中国武汉博士德生物工程有限公司，鼠抗人VEGF单克隆抗体、鼠抗人EGFR单克隆抗体及通用型SP试剂盒均购自中国北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3免疫组织化学法每例标本取病变组织一块，中性甲醛固定后，石蜡包埋，4 μm连续切片，二甲苯脱蜡，稀释酒精连续水化，抗原修复，3%的新鲜过氧化氢-甲醇阻断，PBS用于所有后续的洗涤，严格按照试剂说明书滴加一抗(一抗浓度均为1∶100)、二抗，DAB显色，苏木精复染，显微镜诊断并采集图片。阳性对照由试剂公司提供，阴性对照用PBS代替一抗。

1.4结果判读VEGF的阳性部位位于细胞浆或细胞膜，呈棕黄色或棕褐色颗粒；HIF-1α的阳性部位位于细胞核，呈棕黄色或棕褐色颗粒；EGFR的阳性部位位于细胞浆或细胞膜，呈棕黄色或棕褐色颗粒。显色结果采用Mattern的半定量方法判读：阳性染色率：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～75%为2分，>75%为3分；染色强度：未着色为0分，着色程度淡为1分，着色程度中等为2分，着色程度强为3分。将两项积分相加，>2分为阳性，≤2分为阴性，由至少2位副高职称病理医师进行诊断。

1.5统计学处理采用SPSS17.0统计软件包对数据进行统计学处理，原发性肺癌和肺良性病变间比较及临床病理特征间比较均采用χ2检验；VEGF、HIF-1α及EGFR之间的相关性分析采用χ2检验及Spearman秩相关分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1VEGF、HIF-1α和EGFR在原发性肺癌组织中的表达

2.1.1VEGF在原发性肺癌组织中的表达及与临床病理特征的关系VEGF的阳性部位位于细胞浆或细胞膜，呈棕黄色或棕褐色颗粒(图1a)。原发性肺癌组织中VEGF的阳性表达率为68.25%，显著高于肺良性病变组织的20.00%，差异有统计学意义(P<0.001)(表1)。原发性肺癌组织中VEGF的阳性表达与年龄、性别及病理类型无关，而与淋巴结转移、吸烟史及临床分期有关(P<0.05)(表2)。

2.1.2HIF-1α在原发性肺癌组织中的表达及与临床病理特征的关系HIF-1α的阳性部位位于细胞核，呈棕黄色或棕褐色颗粒(图1b)。原发性肺癌组织中HIF-1α的阳性表达率为55.56%，显著高于肺良性病变组织的13.33%，差异有统计学意义(P<0.001)(表1)。原发性肺癌组织中HIF-1α的阳性表达与年龄、性别及病理类型无关，而与淋巴结转移、吸烟史及临床分期相关(P<0.05)(表2)。

2.1.3EGFR在原发性肺癌组织中的表达及与临床病理特征的关系EGFR的阳性部位位于细胞浆或细胞膜，呈棕黄色或棕褐色颗粒(图1c)。原发性肺癌组织中VEGF的阳性表达率为47.62%，显著高于肺良性病变组织的13.33%，差异有统计学意义(P=0.001)(表1)。原发性肺癌组织VEGF的阳性表达与年龄、性别、病理类型及吸烟史无关，而与淋巴结转移和临床分期相关(P<0.05)(表2)。

a：VEGF的阳性表达

b: HIF-1α的阳性表达

c：EGFR的阳性表达图1　VEGF、 HIF-1α、 EGFR 在原发性肺癌组织中的阳性表达(SP染色×200)

2.2VEGF、HIF-1α和EGFR在原发性肺癌组织中表达的相关性

2.2.1VEGF和HIF-1α在原发性肺癌组织中表达的相关性在原发性肺癌组织中，VEGF与HIF-1α均阳性者占44.44%，VEGF与HIF-1α均阴性者占20.63%，HIF-1α在VEGF阳性组和阴性组中的阳性表达率分别为65.12%和35.00%，差异有统计学意义，VEGF与HIF-1α的表达呈正相关(r=0.279，P<0.05)(表3)。

表3　原发性肺癌组织中VEGF与HIF-1α表达的关系/例

2.2.2EGFR和VEGF在原发性肺癌组织中表达的相关性在原发性肺癌组织中，EGFR与VEGF均阳性者占39.68%，EGFR与VEGF均阴性者占23.81%， VEGF在EGFR阳性组和阴性组中的阳性表达率分别为83.33%和54.55%，差异具有统计学意义，EGFR与VEGF的表达呈正相关(r=0.295，P<0.05)(表4)。

表4　原发性肺癌组织中EGFR与VEGF表达的关系/例

2.2.3EGFR和HIF-1α在原发性肺癌组织中表达的相关性在原发性肺癌组织中，EGFR与HIF-1α均阳性者占33.33%，EGFR与HIF-1α均阴性者占30.16%，HIF-1α在EGFR阳性组和阴性组中的阳性表达率分别为70.00%和42.42%，差异具有统计学意义，EGFR与HIF-1α的表达呈正相关(r=0.267，P<0.05)(表5)。

表5　原发性肺癌组织中EGFR与HIF-1α表达的关系/例

3讨论

VEGF是迄今发现的功能最强、特异性最高的血管生成调控因子，其不仅可以促进肿瘤血管内皮细胞的增殖，还能增加血管的通透性，对肿瘤细胞的增殖起到重要的促进作用[5]。已有研究发现，VEGF在原发性肺癌中的阳性表达率为35%～79%[6-7]。本研究中，VEGF在原发性肺癌组织中的阳性表达率为68.25%，显著高于肺良性病变组织，差异有统计学意义，与文献[2]的结果一致。原发性肺癌组织中VEGF的阳性表达与年龄、性别及病理类型无关，而与有无淋巴结转移、吸烟及临床分期有关，有淋巴结转移者中VEGF的阳性表达率明显高于没有淋巴结转移者，吸烟者VEGF阳性表达率高于无吸烟者，临床分期Ⅲ～Ⅳ期的患者VEGF阳性表达率高于Ⅰ～Ⅱ期者。本研究中VEGF的阳性表达率与淋巴结转移密切相关，表明VEGF在原发性肺癌的转移过程中发挥重要的作用。已有研究表明，VEGF不仅可促进肿瘤组织血管的形成，还可促进肿瘤周边淋巴管的生成，从而帮助肿瘤细胞更快地转移[8]，本研究结果与其一致。此外，VEGF的阳性表达率还与临床分期和吸烟史相关，临床分期越高，VEGF阳性率越高，表明VEGF在原发性肺癌的发生和发展中起推动作用，还能反映原发性肺癌的严重程度，与已有研究结果一致[9]。有吸烟者VEGF阳性率高于无吸烟者，可能原因为烟雾通过刺激呼吸道新生血管上调VEGF的表达，也可能是吸烟者大多有不同程度的支气管肺炎等病变，通过炎症等刺激间接上调VEGF的表达。

HIF-1是一种包括α、β 2个亚单位的异二聚体，其中HIF-1α位于细胞核，主要受缺氧状态的调节，在肿瘤的发展与转移过程中发挥重要促进作用。本研究中，HIF-1α在原发性肺癌组织中的阳性表达率为55.56%，显著高于肺良性病变组织，差异有统计学意义，与已有研究结果一致[10]。原发性肺癌组织中HIF-1α的阳性表达率与年龄、性别及病理类型无关，而与有无淋巴结转移、吸烟史及临床分期相关。此外，在原发性肺癌组织中，VEGF阳性组HIF-1α的阳性表达率高于VEGF阴性组，差异有统计学意义，两者呈正相关。已有研究表明，VEGF可能是HIF-1α发挥作用的重要靶基因之一，当细胞缺氧时，HIF-1α不仅可以直接对VEGF的转录起到促进作用，同时还可以通过增加VEGF mRNA的稳定性来发挥作用，从而促进VEGF的表达[11]，本研究与其一致，表明VEGF和HIF-1α在原发性肺癌的发生、发展及转移过程中可能具有协同作用。

EGFR是一种具有酪氨酸激酶活性的膜受体，能与表皮生长因子等配体结合形成二聚体，激活自身的酪氨酸激酶活性，使酪氨酸残基发生磷酸化，进而通过下游的几条信号通路实现信号传递。已有研究证实，EGFR的过度表达与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移密切相关[12]。本研究中，EGFR在原发性肺癌组织中表达的阳性表达率为47.62%，高于肺良性病变组织，差异具有统计学意义，与已有研究结果一致[13]。原发性肺癌组织中EGFR的阳性表达率与年龄、性别、病理类型及吸烟史无关，而与有无淋巴结转移和临床分期相关，表明EGFR与原发性肺癌的发展和转移相关。但也有研究认为EGFR的过表达更易发生于女性、腺癌和非吸烟患者[14]。本研究结果显示，原发性肺癌组织中VEGF、HIF-1α和EGFR的阳性表达率均显著高于肺良性病变组织，分别对VEGF、HIF-1α和EGFR进行相关性分析，结果显示EGFR与VEGF、HIF-1α均呈正相关，表明EGFR与VEGF、HIF-1α在原发性肺癌的发生、发展及转移过程中可能具有协同作用，可能由于EGFR的异常表达导致肺癌细胞的过度增殖，使肿瘤组织对氧的需求增加，细胞处于缺氧状态，促进VEGF和HIF-1α的表达。已有的研究结果显示，EGFR能通过增加VEGF表达的作用增加肿瘤内新生血管的形成，去除EGFR的作用后，肿瘤内血管生成减少[15]；EGFR通过PI3K/AKT通路，促进HIF-1α表达的上调，协同调节肿瘤细胞的增殖和侵袭[16]。

肺癌的发生是多因素、多阶段协同作用的结果。本研究显示，VEGF、HIF-1α和EGFR均与原发性肺癌的淋巴结转移和临床分期相关，且三者之间的表达均具有相关性，说明VEGF、HIF-1α和EGFR在原发性肺癌的发展、转移过程中具有协同作用。本研究通过实验研究及统计学论证，说明VEGF、HIF-1α和EGFR的表达与原发性肺癌相关，以期为研究原发性肺癌的发病机制提供进一步帮助，也为后续的预防和临床治疗提供科学依据。

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(本文编辑杨晨晨)

基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金(2014211C115)

作者简介：张冉(1989-)，男，在读硕士，研究方向：肺癌的病理诊断与研究。 通信作者：马晓梅,女，硕士，主治医师，研究方向：肿瘤的病理诊断与研究，E-mail：ma.xm006@163.com。

中图分类号：R734.2

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)08-0992-05

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.08.015

[收稿日期：2015-12-24]

Expression and correlation analysis of VEGF, HIF-1α and EGFR in primary lung cancer

ZHANG Ran， Muhtar Tursun， MA Xiaomei

(DepartmentofPathology,theAffiliatedTumorHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression and its correlation of vascular endothelial growth factor (VEGF), hypoxia inducible factor (HIF-1α) and epidermal growth factor receptor (EGFR) in primary lung cancer. Methods63 cases of primary lung cancer and 26 cases of benign lung disease were collected to detect the expression of VEGF HIF-1α and EGFR with immunohistochemical method in the lung cancer tissues and benign lung lesions. ResultsThe positive rate of VEGF, HIF-1α and EGFR in the primary lung cancer tissues were all significantly higher than that in the lung benign lesions (68.25% vs 20.00%, P<0.001; 55.56% vs 13.33%, P<0.001; 47.62% vs 13.33%, P=0.001 respectively). The positive expression of VEGF vs HIF-1α, VEGF vs EGFR and HIF-1α vs VEGF in the primary lung cancer tissues were positively correlated (r=0.279, 0.295 and 0.267 respectively, P<0.05 for the three couples). The positive expression of and HIF-1α in the primary lung cancer tissues was correlated with lymph node metastasis, smoking history and clinical stage, and the positive expression of EGFR was related to lymph node metastasis and clinical stage. ConclusionVEGF, HIF-1α and EGFR were involved in the occurrence and development of primary lung cancer, and there was a synergistic effect among the three.

Keywords:lung cancer; VEGF; HIF-1α; EGFR

·基础医学研究·