类鼻疽伯克霍尔德菌胞内运动相关蛋白BimA的生物学特性研究进展

胡　艺，方　瑶，毛旭虎



类鼻疽伯克霍尔德菌胞内运动相关蛋白BimA的生物学特性研究进展

胡艺，方瑶，毛旭虎

第三军医大学西南医院医学检验系临床微生物及免疫学教研室，重庆400038

摘要：类鼻疽伯克霍尔德菌是一种热带医学病原体，现被美国CDC提升为I类致病菌严加防范。类鼻疽伯克霍尔德菌所导致的疾病称为类鼻疽，致死率和复发率都很高，广泛流行于东南亚及我国南海周边地区，已成为严峻的公共卫生问题。作为一种兼性胞内菌，类鼻疽伯克霍尔德菌的胞内运动能力为其逃逸机体免疫和细胞间的扩散提供了重要基础。胞内动力相关蛋白A(BimA)是一种类鼻疽菌自分泌的、与其胞内运动相关的关键分子，它通过操控肌动蛋白实现干预细菌的胞内运动，在类鼻疽菌的感染和致病中发挥着重要作用。全面、深入地了解BimA在类鼻疽菌感染中的作用机制对寻找有效预防和控制该病原的传播等方面具有重要意义。本文即综述了BimA蛋白的生物学特性分析，结合研究报道探讨其主导细菌胞内运动、干扰宿主胞内免疫、实现细菌胞间传播的机制及意义。

关键词：类鼻疽伯克霍尔德菌(类鼻疽菌)；BimA；肌动蛋白

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类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderiapseudomallei)，简称类鼻疽菌，是一种革兰阴性杆菌，兼性胞内寄生，广泛分布于澳洲北部、东南亚和我国的海南、福建和广东等地。该菌主要存在于疫源地的水或土壤中，极易感染机体和在环境中传播[1]。类鼻疽菌隶属伯克霍尔德菌属，其同属常见的还有致病的鼻疽伯克霍尔德菌(B.mallei)和不致病的洋葱伯克霍尔德菌(B.cepacia)[2]。类鼻疽菌导致的疾病称类鼻疽(melioidosis)，是一种热带疾病，死亡率达40%，复发率在20%以上，目前已成为全球的一个重要公共卫生问题[3]。类鼻疽发病一般为散发且因可长期潜伏感染或仅为轻型病例，故发病无明显季节性。患者多与接触流行区含有本菌的水和土壤有关。农民、军人、矿工、探险者和疫区原居民是类鼻疽的高危人群。患者的免疫状态会影响疾病初期和随后的病程。由于它的临床表现多种多样被比作“高超的模仿者”。急性类鼻疽的死亡率达90%，慢性主要以脏器炎性瘤为主。急性型类鼻疽一般潜伏期4～5 d，常有严重寒战、高热、咳嗽、咯血等症状，多因败血病死亡，亚急性多为局部症状，呼吸道症状，深部脏器脓肿也很常见；以上表现可转为慢性，而且与其他菌引起的这类疾病难以区别，常因误诊延误治疗。由于各级诊断条件限制以及临床医生对该病陌生，临床诊断极难。由于类鼻疽菌有天然的耐药性，且耐药程度又因菌株不同而异，给临床治疗带来了极大的困难[4]。

类鼻疽菌具有入侵宿主细胞和逃离吞噬体的能力。已有文献表明，宿主细胞里的类鼻疽菌及其同属的鼻疽伯克霍尔德菌和伯克霍尔德菌均能够诱导宿主肌动蛋白为主要媒介的胞内运动，通过不同的肌动蛋白的聚合机制介导其在胞内的运动和播散。这些与其自分泌的特殊功能蛋白BimA(Burkholderiaintracellular motilityA，BimA)密切相关[5]。鉴于类鼻疽菌的特殊性、流行的严峻性及对胞内重要病原免疫逃逸机制了解的必要性，充分认识BimA的生物学功能、作用机制，对我们进一步研究该菌的胞内感染机制和靶向疫苗的抗原筛选都有重要的理论指导意义。本文将从BimA的发现、蛋白结构、生物学功能等几个方面进行综述，并结合本室的研究进行小结和探讨。

1BimA的发现

类鼻疽菌能侵入几乎所有宿主细胞，同时还能快速地逃离吞噬体或其它的束缚其增殖的模性结构，最终进入胞浆实现快速增殖和播散[6]，而类鼻疽菌的毒力因子在该菌的致病中发挥着重要作用。类鼻疽菌毒力因子众多，包括荚膜多糖、菌毛、鞭毛、脂多糖、群体感应分子、分泌系统、毒素BLF1以及介导其胞内运动的蛋白等[7]。近年来，随着类鼻疽菌全基因组测序工作的进展以及生物信息学的迅猛发展，类鼻疽菌毒力因子的预测、分析和研究得到了极大的促进，但认清各个毒力因子在病原菌的感染机制中的作用和具体功能仍是一大难题[8]。2005年Stevens MP等通过对类鼻疽菌进行基因组学分析发现类鼻疽菌能够自主分泌一种富含脯氨酸的蛋白即BimA(Burkholderiaintracellular motilityA，BimA)。BimA是一种自转运复合体，呈三聚体功能结构，与福氏志贺菌自分泌的ISCA/VirG蛋白有一定的氨基酸序列相似性。同时也发现它的羧基端保留有一段信号肽(signal peptide，SP)，而氨基末端暴露在细菌的外膜表面[5]。为了有助于胞内运动，类鼻疽菌BimA模拟宿主Arp2/3激活剂或Ena/VASP肌动蛋白聚合酶实现激活宿主肌动蛋白的聚合促成肌动蛋白介导的伸缩运动，进而推动细菌穿过宿主细胞膜扩散到胞内，实现免疫逃逸[9-10]。

2BimA蛋白结构

BimA由类鼻疽菌BPSS1492基因编码，该基因位于类鼻疽菌的2号染色体上.bimA全长1 780 bp。BimA是一个假定的自分泌蛋白，由529个氨基酸组成。其一级结构如图1所示。该蛋白编码的主要基序包括：NIPV基序(NIPVPPPMPGGGA重复序列)，PRM1(Proline rich motif 1,富含脯氨酸基序)，WH2基序(WASP homology domain 2)和PDAST(预测假定酪氨酸蛋白激酶2磷酸化位点重复序列) 。在其C-末端位置上还有一个假设的横跨膜锚点TM。这个区域跟小肠耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)粘附素YadA氨基酸羧基端序列相似[6]。YadA的羧基端上包含了9个可以改变疏水性的氨基酸通常以苯丙氨酸或色氨酸结尾。这些氨基酸在革兰氏阴性菌的外膜组成了特定的基序，对寡聚化起着重要作用[11]

先前研究认为BimA含有两个WH2基序，序列不同但在特定位置上碱基一致，这表明肌动蛋白单体结合WH2区域中关键残基的重要性。2015年，Erin LB等在研究BimA蛋白结构的基础上提出了新的见解。BimA结构中包含3个WH2，每个WH2由大约35个氨基酸组成。通过丙氨酸替代保守的LKKT基序上的两个特征序列实验确定3个WH2都能与肌动蛋白结合。进一步通过肌动蛋白聚合装配实验研究3个不同的WH2突变株只有W1和W2具有肌动蛋白成核的能力而W3没有作用。这推翻了先前一些研究表明蛋白结构上只有2个WH2的结论。同时作者在氨基酸430-470的位置上又发现了对细菌的运动效率有重要作用的三聚化卷曲尾巴[12]。这使我们更加清楚地了解了该蛋白结构并且得到一致性提示BimA可能与蛋白运动有着密切的关系。

图1　类鼻疽菌BimA的结构模式图

Fig.1Domain schematics of BimA from Burkholderia pseudomallei

3BimA的生物学功能

类鼻疽菌的运动包括胞内和胞外两种形式。胞内运动通常是细菌体内某些蛋白分子形成的肌动蛋白尾提供动力，而鞭毛和菌毛等结构主要介导细菌的胞外运动。前者无疑是关乎胞内菌致病机制的关键，也是类鼻疽菌胞内运动的重要研究热点。正如1990年发现的胞内细菌病原李斯特氏菌和福氏志贺菌那样，它们通过自身分泌的蛋白来招募宿主体内的单体肌动蛋白，推动细菌穿过胞膜。WASP家族蛋白可以激活Arp2/3复合体，影响下游肌动蛋白聚集[13]。李斯特氏菌分泌蛋白ActA是WASP家族蛋白的一员[14]。福氏志贺菌的外膜蛋白IcsA/VirG11也能与N-WASP发生相互作用。立克次氏体在早期感染中也能分泌RickA蛋白模拟WASP家族蛋白招募Arp2/3诱导宿主肌动蛋白聚集，使细菌产生运动能力[15]。

Benanti EL等通过进行一系列实验，包括BimA蛋白的体外测定、突变分析、分子聚合动态分析(共聚焦方法)和噬斑实验，分析类鼻疽菌如何实现对宿主肌动蛋白的聚集、宿主细胞间的融合和最终从一个受感染的宿主细胞扩散到附近的其它细胞。他们发现在感染期间细菌的BimA需要一个或多个WH2基序来引导宿主肌动蛋白运动和融合。WH2基序则激活Ena/VASP复合体，Ena/VASP寡聚体化促使宿主肌动蛋白成核。伯克霍尔德菌(B.thailandensis)的BimA只有在Arp2/3存在的情况下才能聚合宿主肌动蛋白。而类鼻疽菌和鼻疽菌的BimA蛋白则不依耐于Arp2/3即可聚合肌动蛋白并在聚合时解离CapZ蛋白，去除其抑制聚合的能力。同时，通过三聚体结构形成更为致密的丝状结构。

综上所述，自转运蛋白BimA促使宿主肌动蛋白为主的运动以及宿主细胞融合及传播。BimA同系物模拟不同宿主肌动蛋白聚合：类鼻疽菌BimA能插入外膜将N末端伸到细菌外，虽没有Arp2/3，类鼻疽BimA仍旧能与带钩尾结合使宿主肌动蛋白成核和让其纤维加长、成束成为其扩散的动力；鼻疽菌BimA利用仅有的一个WH2基序以同样的机制

图2　细菌的肌动蛋白运动机制示意图

形成成束纤维；而伯克霍尔德菌BimA必须激活宿主Arp2/3复合物从而使宿主肌动蛋白聚集成核。通过比较伯克霍尔德菌、鼻疽菌和类鼻疽菌三者形成的肌动蛋白尾发现：伯克霍尔德菌的肌动蛋白尾是弯曲的，其它两个都是直的[12]。虽然它们属于同一菌属，具有相似的BimA蛋白序列、类似的肌动蛋白成核能力，但是具体BimA蛋白介导细菌的胞内运动机制又不一样。BimA不同聚合机制使之有不同的肌动蛋白聚集方式和运动，这是影响感染的重要因素。(见图2)

4结语

类鼻疽高发于东南亚、澳大利亚北部、印度次大陆和中国南部等地。类鼻疽同时也在西半球蔓延。它在西半球的流行区域主要在波多黎各和巴西，散发病例则在美洲中部、南美洲和加勒比海的部分区域。类鼻疽在美国的病例很少，每年只有0-5例，大多是从该病流行区域旅游归来的游客[16]。该疾病的大暴发通常与天气有关比如热带风暴和特大暴雨。1991年在我国首次由广东湛江报告4例病人,随后海南、广东、广西南部的边缘热带和南亚热带地区成为中国类鼻疽疫源地。2005年台湾南部地区由于发生大雨冲刷导致病原播散，造成了类鼻疽爆发感染事件[17]。而近年来在青海、重庆等内陆地区也有病例出现[18-19]。

BimA作为为数不多的研究较清楚的类鼻疽菌毒力因子，对其机制的探讨和认识为我们研究类鼻疽菌的毒力提供了更多的参考和借鉴。BimA类似于汽车“马达”，在细菌传播中提供动力，促进多核巨细胞(multi-nuclear giant cell，MNGC)的形成。通过对类鼻疽BimA蛋白质结构解析及其作用于人体细胞的分子生物学机制研究后发现病原菌适应宿主、逃避宿主免疫逃逸的超凡能力和惊人的进化能力。类鼻疽菌已经可以通过自身分泌的某些蛋白来模拟不同的宿主肌动蛋白成核因子，介导聚合宿主肌动蛋白，形成肌动蛋白尾，实现细菌在胞内运动，达到感染播散，拓展生存空间的目的。

另外，类鼻疽菌中除了BimA是否还有其它能控制宿主细胞重要功能或者模拟、翻转这些功能以实现感染、促进共生的蛋白呢，这当然还有待进一步的生物信息学和蛋白质组学的研究。总之，BimA的发现和研究对寻找预防和控制类鼻疽菌的手段提供了新的靶点。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.015

通讯作者：毛旭虎, Email: maoxh2012@hotmail.com

中图分类号：R37

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)03-0286-04

Corresponding author:Mao Xu-hu, Email: maoxh2012@hotmail.com

收稿日期：2015-08-13；修回日期:2016-01-12

Biological characteristics and research progress about Burkholderia pseudomallei intracellular movement associated protein (BimA)

HU Yi,FANG Yao,MAO Xu-hu

(DepartmentofClinicalMicrobiologyandImmunology,CollegeofMedicalLaboratoryScience,SouthwestHospital,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)

Abstract:Burkholderia pseudomallei, a tropical medicine pathogen, is listed as Titer I’ pathogen by US Centers for Disease Control and Prevention. It is widely spread in Southeast Asia and the surrounding area of the South Sea of China. Its associated disease is melioidosis, with a high mortality and relapse rate, which has become a serious problem for public health. As an intracellular bacteria, its ability for intercellular motility plays a key role in its immunity escape and cell-to-cell diffusion. Burkholderia pseudomallei intracellular movement associated protein (BimA), an auto-secreted protein of B. Pseudomallei, takes part in manipulating intracellular actin function and associates with the pathogenicity of B. Pseudomallei. Comprehensive and in-depth understanding about BimA and associated mechanism would benefit prevention and control of the pathogen. This review focuses on the biological characteristics and research progress about BimA to discuss its roles in B. Pseudomallei intracellular movement, immunity escape and cell-to-cell diffusion.

Keywords:Burkholderia pseudomallei; BimA; actin aggregation

国家自然科学基金( No.81471914)