胞外肌动蛋白检测的临床应用①

全紫瑶 吴兆立 谢圣高 崔天盆

(武汉市第一医院检验科，武汉430022)

肌动蛋白存在于真核细胞中，作为微丝的结构蛋白，以两种形式存在，即单体和多聚体。肌动蛋白单体是由一条多肽链构成的球形分子，又称球状肌动蛋白(Globular actin，G-actin)，球状肌动蛋白在一定条件下聚合形成肌动蛋白丝，称为丝状或纤维状肌动蛋白(Filamentous actin，F-actin) 。哺乳动物单体形式的肌动蛋白根据等电点的不同分为六种亚型：三种α-肌动蛋白，分布于各种肌细胞中，根据肌细胞特异性分为α-骨骼肌肌动蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、α-心肌肌动蛋白；两种γ-肌动蛋白，包括只存在于平滑肌的γ-平滑肌肌动蛋白和存在于所有细胞胞浆中的γ-肌动蛋白；一种β-肌动蛋白，存在于所有细胞的胞浆中[1]。

胞内肌动蛋白微丝系统参与各种细胞生命活动过程、如参与细胞形态维持及运动调节，确保了细胞与细胞间、细胞与细胞外基质成分、细胞与各种人造生物材料的相互作用。肌动蛋白细胞骨架在囊泡运输、胞内区室化及各种大分子在胞内的定位过程中发挥关键作用[2]。它存在于细胞毒性T细胞和NK细胞为迅速溶解受感染的细胞或肿瘤细胞而建立的免疫突触囊泡中，影响溶菌性颗粒的释放[3]。它的重构及相应的不同肌动蛋白亚型的表达与细胞分化的过程密切相关。在程序性细胞死亡(Programmed cell death,PCD)的不同阶段中，也有着相当明确且重要的作用，这种类型的PCD被称为肌动蛋白介导的细胞凋亡[2]。有研究表明肌动蛋白也可以存在于细胞核中，在染色体重构、RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ转录及mRNA加工处理过程中发挥关键作用。肿瘤细胞在血管中扩散迁移时，肌动蛋白有助于肿瘤细胞的存活，建立其与血液中的红细胞和血小板的有效联系，使其免于免疫系统的攻击。同时，肿瘤细胞膜上侵袭性伪足中富含肌动蛋白，有助于其穿过血管壁和细胞外基质外渗到新的部位，增加了肿瘤细胞的迁移潜力和侵袭性，可以作为观察癌症进展和评估治疗的靶点[4]。

在细胞膜完整性受损的情况下，肌动蛋白被释放到细胞外。在这种情况下，F-肌动蛋白就成为一种所谓的危险相关分子模式(Danger-associated molecular patterns,DAMPs)的一员，使机体“感受到危险”，并通过趋化和激活抗原递呈细胞(APC)等免疫细胞增强固有和适应性免疫应答。目前发现的警报素家族成员主要包括以下几类：①抗菌肽(Antimicrobial peptides and proteins，AMPs)家族；②高迁移率族蛋白(High mobility group,HMG)；③IL-1家族；④热休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)家族；⑤S100蛋白 (S100 proteins )家族；⑥三磷酸腺苷(ATP)嘌呤家族；⑦冷诱导RNA结合蛋白(Cold-inducible RNA binding protein,CIRP)。在没有损伤和感染时，警报素发挥着重要的生理作用。在压力和生理应激、组织损伤、炎症反应时迅速释放，激活和增强机体免疫防御系统[5]。

1 细胞膜外表面肌动蛋白与临床

研究表明细胞膜外表面膜连肌动蛋白可参与多种生理与病理过程。有研究表明，精子头部特别是位于精子赤道部和顶体部位的，膜表面可表达F-肌动蛋白能帮助精子进入卵细胞。精子发育成熟过程中细胞膜外表面发生肌动蛋白的聚合反应，可能对受精过程至关重要[2，6]。但精子细胞不会受到机体免疫系统的攻击，因为有血睾屏障的保护，睾丸组织可以隔绝免疫系统的相关组分，从而避免其针对F-肌动蛋白产生相应的免疫应答反应的可能[2]。

膜连肌动蛋白可以作为纤溶酶原结合位点，这对于纤溶系统来说，意义相当重大。另外，脂蛋白a也能与内皮细胞膜表面肌动蛋白相互作用，并竞争性结合纤溶酶原的肌动蛋白结合位点，纤溶酶的产生因此而减少，导致纤溶活性减弱。含有儿茶酚胺的细胞膜表面的γ-肌动蛋白和β-肌动蛋白能与纤溶酶原结合，促进纤溶酶的生成，从而调节神经递质的释放[7]。内皮细胞膜外表面膜连α-平滑肌肌动蛋白可作为血管生成素受体，从而诱导血管生成。在组织型纤溶酶原激活物(tPA)的作用下，血管生成素-肌动蛋白受体复合物同肌动蛋白一样，可促进纤溶酶的产生。与肌动蛋白相比，血管生成素-肌动蛋白受体复合物并不会抑制纤溶酶活性[2]。 因此，在血管生成过程中，血管生成素促进了细胞外基质的降解，使内皮细胞能够穿透基底膜并不断延伸[8]。这种纤溶酶原激活机制可能也参与到某些病理过程中，乳腺癌患者癌组织中过量表达纤溶酶原激活级联反应中的一些组分，如尿激酶，导致肿瘤细胞表面产生大量的纤溶酶，促进了肿瘤的转移及扩散，对患者预后极为不利[7]。研究表明一些肿瘤细胞系(PC-3、HT1080及MDA-MB321)细胞膜表面表达的β-肌动蛋白，促进血管抑制素4.5的生成。血管抑制素4.5能够抑制内皮细胞的增殖及迁徙延伸，并启动其发生程序性细胞死亡，抑制肿瘤新生血管的形成从而抑制肿瘤的进展。因此，肿瘤细胞膜表面β-肌动蛋白表达水平可作为判断预后的指标[2]。

2 循环游离肌动蛋白与临床

有研究表明，肌动蛋白可以进入循环系统如血液、脑脊液及其他生物体液，如淋巴液、尿液、支气管肺泡灌洗液中,不仅可以作为细胞损伤的标志物，而且可能有直接的致死效应。向大鼠血管内注射G-肌动蛋白，其可在血管内自我组装聚合形成肌动蛋白微丝,导致微血栓的形成及内皮损伤。与G-肌动蛋白相比，由于结合了ADP,F-肌动蛋白能够激活血小板的聚集反应，抑制了纤溶酶的活性，阻止纤维凝块的溶解从而造成血栓。外源性肌动蛋白也可作为一种循环游离肌动蛋白，与内皮细胞膜表面的肌动蛋白竞争性地结合血管生成素，从而抑制毛细血管的修复作用[2]。鉴于循环游离肌动蛋白的负面作用，血浆中也相应存在胞外肌动蛋白隔离与清除系统，涉及凝溶胶蛋白(gelsolin)与族特异性成分球蛋白(Gc-globulin)的参与，后者又被称为维生素D结合蛋白(vitamin D binding protein,DBP)，两者共同作用将肌动蛋白从循环系统中清除。凝溶胶蛋白结合F-肌动蛋白并将其降解为G-肌动蛋白，Gc-globulin结合降解的单体G-肌动蛋白并加速其从循环系统中清除[9]。

2.1急性炎症性疾病 心肌梗死患者，尤其是在急性前壁心肌梗死情况下，血液中α-肌动蛋白浓度水平可达到最高。Ⅱ型糖尿病及糖尿病肾病患者血清中高水平的α-肌动蛋白是患者发生急性心肌梗死或心绞痛的高危因素。另外，心绞痛患者根据布朗沃尔德分型标准，当病情严重程度达到Class ⅢB时，患者血清中可检测到高浓度的α-肌动蛋白[2]。坏死性小肠结肠炎患者血浆中α-肌动蛋白同样也有升高，因此，α-肌动蛋白可用于小肠肌肉受损的诊断[10]。肝细胞坏死和脓毒性休克时，释放入血液中的肌动蛋白含量与其致死效应的相关性研究在临床实践中也有报道[9，11]。

急性肺损伤时，大量的肌动蛋白被释放到细胞外环境中，外周血中可检测到肌动蛋白/凝溶胶蛋白复合物[12]。重症监护室患者由于血浆凝溶胶蛋白水平下降，死亡率大大上升，住院时间及依赖呼吸机的时间都将延长。病情改善后，患者血浆凝溶胶蛋白水平上升[13]。经过血液透析的患者，由于血浆中凝溶胶蛋白丢失，易患上全身性炎症疾病，同时导致一年观察期内患者死亡概率增加[2]。

爆发性肝坏死患者血液中Gc-globulin水平降低，死亡患者更是如此，提示肝脏可能是机体产生该蛋白的主要器官。血清中Gc-globulin水平降低，肌动蛋白/Gc-globulin复合体浓度大大升高与急性肝衰竭患者的不良预后相关[2]。车祸或烧伤后持续处于高危状态的患者，血浆中凝溶胶蛋白水平降低，导致患者死亡率升高[14]。

败血症及器官衰竭时，释放入循环系统的肌动蛋白含量增多，清除系统的功能缺陷，血浆凝溶胶蛋白浓度水平降低，且浓度降低的程度与死亡率相关,可导致相应并发症尤其是呼吸窘迫和血小板减少症的发生[15]。脓毒性休克时Gc-globulin可以结合花生四烯酸，但当Gc-globulin与肌动蛋白结合形成复合体时，其结合花生四烯酸的能力下降。肌动蛋白清除系统相关成分与肌动蛋白的结合也干扰了其与活性脂类物质结合，从而阻止其发挥相应的抗炎性免疫调节作用。血清中Gc-globulin水平显著降低，而肌动蛋白/Gc-globulin复合体的百分比显著升高，并且该复合体的浓度与疾病严重性及患者死亡率高度相关[2]。Sprague Dawley大鼠的肠系膜淋巴液中也存在肌动蛋白与凝溶胶蛋白，且其浓度与血浆中含量相当[14]。出血性休克时，肠系膜淋巴液中的凝溶胶蛋白含量显著降低。而该蛋白水平的下降又会导致促炎性脂类物质的生物活性增强，造成肺及其他器官的毛细血管损伤[2]。

2.2慢性炎症性疾病 在各种慢性炎症疾病如多发性硬化(Multiple sclerosis，MS)、老年痴呆症(Alzheimer′s Disease，AD)、中风(Ischemic stroke,IS)以及哮喘的不同活动期中，患者会出现低凝溶胶蛋白血症[2]。多发性硬化-实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型血液中的凝溶胶蛋白浓度也降低[2，16]。中风后患者的血浆凝溶胶蛋白含量也减少，并且该蛋白水平的下降发生在多器官衰竭之前[17]。哮喘患者的支气管肺泡灌洗液中的凝溶胶蛋白表达也增强[2]。

神经退行性病变患者脑脊液中的肌动蛋白水平较高，且其浓度变化与疾病进展相关。阿尔兹海默症患者脑脊液中的凝溶胶蛋白可以结合β-淀粉样蛋白，抑制β-淀粉样蛋白的沉积并对其进行水解，而凝溶胶蛋白浓度显著降低，升高的肌动蛋白水平可能会削弱凝溶胶蛋白的保护作用，导致神经退行性疾病的进展[2]。

2.3自身免疫性疾病 细胞外肌动蛋白可作为自身抗原参与多种自身免疫性疾病的病理过程，细胞毒性T淋巴细胞及树突状细胞膜表面检测到特异性表达F-肌动蛋白识别受体——C型凝集素9家族A成员(C-type lectin domain family 9 member A,CLEC9A)，也称为树突状细胞-NK细胞凝集素群受体1(DC-NK lectin group receptor-1,DNGR-1)，可诱发自身免疫性疾病[18]。研究表明，肌动蛋白与补体系统中C1q成分也有相互作用，肌动蛋白微丝可激活C1q，从而激活补体的级联激活反应，这一过程不需抗体的参与[2]。抗肌动蛋白抗体参与Ⅰ型自身免疫性肝炎的发生发展，血液中出现以F-肌动蛋白为特异性免疫球蛋白靶抗原是该病的一个重要的诊断标准，高滴度的抗肌动蛋白抗体往往伴随有肝脏炎症活动性指标的升高,可作为疾病预后不良的标志[19]。丙型病毒性肝炎患者血清中往往出现高滴度的抗F-肌动蛋白抗体，说明丙肝病毒可诱导机体对肝脏组织的自身免疫性攻击反应增强[20]。

肌动蛋白可作为一种自身抗原，诱导动脉粥样硬化患者中的Th1介导的细胞免疫反应的发生，参与该病各种系统性炎性并发症的发生发展[21]。抗肌动蛋白抗体滴度水平，与动脉粥样硬化过程中，颈动脉内中膜厚度与外膜直径的比值呈正比，即该抗体水平与脑血管意外事件的发生高度相关。急性冠脉综合征患者血清中可出现抗肌动蛋白与抗肌球蛋白IgG抗体，抗体浓度越高，对心肌的损伤严重程度越重[2]。乳糜泻患者体内的抗肌动蛋白IgA抗体与小肠发生肠绒毛萎缩密切相关，且高滴度的抗肌动蛋白IgA抗体可作为小肠黏膜受损严重程度及肠绒毛萎缩病变的标志物[22]。

IgA肾病患者血清中可检出能与肌动蛋白结合的IgA抗体，原发性肾病综合征患者血清中可出现抗肌动蛋白IgM抗体。自身免疫性内耳疾病(如梅尼埃病、突发性耳聋、快速进行性感觉神经性耳聋及耳硬化)以及肌萎缩侧索硬化症患者血清中可检出抗β-肌动蛋白抗体[2]。

3 结语

综上所述，肌动蛋白的功能不仅仅局限于其基本的生物学角色——作为细胞骨架的一种成分，肌动蛋白可也存在于细胞外环境中，不仅对细胞有直接的毒性作用，对凝血系统也有负面影响，而且削弱了肌动蛋白清除系统相关成分的抗炎性作用。另外，F-肌动蛋白可作为一种自身抗原，参与自身免疫性疾病的发生发展，疾病相关抗肌动蛋白抗体可作为多种疾病的预后生物标志物[2]。F-肌动蛋白介导多种病理生理过程与临床疾病的发生发展紧密相关，可以作为合适的分子标记物，为疾病诊断提供可信赖的依据。进一步研究肌动蛋白在细胞外的存在形式，及其在生理与病理反应过程中的作用，不仅仅对基础医学，更是对许多重大疾病的诊断、预防及治疗有重要意义。