皮层肌动蛋白络氨酸磷酸化对宫颈鳞状上皮细胞癌发展研究
2019-06-03申英姬陈海月
申英姬, 陈海月
1.大连市妇女儿童医疗中心 妇产科,辽宁 大连 116010;2.延边大学附属医院 病理科,吉林 延吉 133000
宫颈癌是严重威胁女性健康的妇科常见恶性肿瘤之一,病死率较高[1]。Src家族相关基因参与细胞生长、分化、增殖和细胞迁移等许多重要生理过程[2-3]。而Src在各种类型的癌症尤其是转移性病变中,可过度活化。皮层肌动蛋白是细胞Src激酶的一种常见底物,由皮层肌动蛋白基因编码,其基因位于人染色体11q13。皮层肌动蛋白的过表达可在多种癌症中检测,与患者的不良预后密切相关[4-5]。皮层肌动蛋白酪氨酸磷酸化是调节细胞内生理活动的重要途径。Src可在体外催化皮层肌动蛋白肽链中3个络氨酸残基Tyrosine421(Tyr421)、Tyrosine466 (Tyr466)和 Tyrosine482(Tyr482)的磷酸化,并参与整联蛋白诱导的细胞扩散及粘附。
磷酸化皮层肌动蛋白在癌症中起重要作用。皮层肌动蛋白的Tyr421、Tyr466和Tyr482的磷酸化可在多种肿瘤细胞中观察到,并在细胞的迁移过程中起关键作用[6]。在胃癌细胞,敲低皮层肌动蛋白可使细胞的运动性降低,而野生型皮层肌动蛋白过表达可使细胞运动性恢复,但Tyr421、Tyr466和Tyr482磷酸化位点突变的皮层肌动蛋白过表达无法恢复细胞移动性[7]。本研究旨在探讨皮层肌动蛋白及磷酸化皮层肌动蛋白下调对宫颈鳞状上皮细胞癌细胞株的增殖、迁移和侵袭能力的影响。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料 本研究选取11例正常宫颈组织标本,61例不典型增生标本,116例宫颈鳞状上皮细胞癌患者组织标本进行实验。标本购自Pantomics (美国)。
1.2 研究方法
1.2.1 免疫化学染色 利用CTTN (美国Abcam公司),phospho-Tyr421-CTTN (美国LifeSpan BioScience公司)和phospho-Tyr466-CTTN (美国LifeSpan BioSciences公司)多克隆抗体进行研究。可视化使用3,3′-二氨基联苯胺,染色使用苏木精。滴加一抗前,组织切片脱蜡至水,利用过氧化氢及甲醇复合物阻断内源性过氧化物酶并进行抗原修复。宫颈鳞状上皮细胞癌细胞在腔室载玻片中培养过夜,磷酸缓冲液洗涤,70%乙醇固定,常规免疫细胞化学染色。
1.2.2 细胞培养及转染 宫颈鳞状上皮细胞癌细胞株HeLa及Siha源自美国模式培养物集存库,细胞株用含有10%胎牛血清的培养基置于37℃,5% CO2孵箱中传代培养。CTTN-shRNA及空白对照序列控制病毒购自美国Origene公司,转染后,嘌呤霉素筛选,建立CTTN 敲除稳定细胞株HeLa△CTTN及Siha△CTTN。
1.2.3 实时定量聚合酶链式反应 利用TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)提取细胞总RNA,再利用1 μg总RNA 及 AccuPower®RT PreMix (韩国Bioneer公司)合成cDNA。实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)用1X SYBR Green PCR Master Mix(美国Applied Biosystems公司)在ABI7500 Real Time PCR 系统下进行。内参照3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物为:5′-AGGTCCACCACTGACACGTT-3′,5′-GCCTCAAGATCATCAGCAAT-3′。MKI67引物为:5′-CCCCCACCAGAACTAACAGA-3′,5′- ACTTTGATGCCCTCATCACC-3′。PCNA引物为:5′-GAAGCACCAAACCAGGAGAA-3′,5′-TCACTCCGTCTTTTGCACAG-3′。
1.2.4 体外增殖、划痕及侵袭实验 本研究利用 HeLa△CTTN及Siha△CTTN细胞进行细胞增殖试验,各组细胞接种到96孔板 (1×104个/孔)进行培养,并用台盼蓝染色法检测各时间点的细胞数,进行比较。每组设4个复孔,试验重复3次。利用HeLa△CTTN、Siha△CTTN细胞进行细胞划痕试验,各组细胞接种到24孔板(1×104个/孔)常规培养过夜。第2天用200 μl微量移液枪头在24孔板内垂直划痕,用磷酸缓冲液及培养液洗细胞2次,加入培养液,常规培养后观察拍照。每组设4个复孔,试验重复3次。利用HeLa△CTTN、Siha△CTTN细胞进行体外侵袭试验,利用胰蛋白酶将常规培养的各组细胞消化成单细胞悬液。将包被有8 μg/μl 基质胶的transwell滤器置于24孔培养板孔中,下室加含有20%牛血清抗原的培养液,上室加细胞悬液。常规培养36 h后,取出transwell滤器,用棉签拭去其滤膜上未迁移细胞,固定染色。利用显微镜观察及任选5个视野拍照,统计细胞数。每组设4个复孔,试验重复3次。对照组保留CTTN基因,干扰CTTN组敲除CTTN基因,即HeLa△CTTN及Siha△CTTN。
1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0统计学软件进行数据分析。计数资料以例(百分率)表示,组间比较采用χ2检验。Mann-Whitney U-检验分析增殖、迁移和侵袭能力在各组细胞之间的差异。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 皮层肌动蛋白及磷酸化皮层肌动蛋白在各组织中表达 皮层肌动蛋白、磷酸化皮层肌动蛋白(Tyr421)和磷酸化皮层肌动蛋白(Tyr466)主要表达于细胞膜及胞浆。皮层肌动蛋白表达在正常宫颈组织、宫颈不典型增生及鳞状上皮细胞癌组织之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与正常宫颈及轻度不典型增生组织比较,磷酸化皮层肌动蛋白(Tyr421)和磷酸化皮层肌动蛋白(Tyr466)的表达在中度、重度不典型增生及鳞状上皮细胞癌组织中显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
2.2 皮层肌动蛋白及磷酸化皮层肌动蛋白表达影响因素分析 宫颈鳞状上皮细胞癌组织中,皮层肌动蛋白的表达与年龄、T分期、淋巴结转移无关(P>0.05)。T分期及淋巴结转移是磷酸化皮层肌动蛋白(Tyr421)和磷酸化皮层肌动蛋白(Tyr466)表达的影响因素(P<0.05)。见表2。
2.3 体外增殖、划痕及侵袭实验结果 增殖实验结果表明,HeLa△CTTN及Siha△CTTN的细胞数显著减弱,MKI67及PCNA mRNA的表达在HeLa△CTTN及Siha△CTTN中显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1、2。提示皮层肌动蛋白及磷酸化皮层肌动蛋白下调,可抑制宫颈鳞状细胞癌细胞生长。划痕、侵袭实验结果表明,与正常细胞比较,细胞的移动性及侵袭性在HeLa△CTTN及Siha△CTTN中显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。提示皮层肌动蛋白及磷酸化皮层肌动蛋白下调,可抑制宫颈鳞状细胞癌细胞迁移性及侵袭性。见图3、4。
表1 皮层肌动蛋白及磷酸化皮层肌动蛋白在正常宫颈、不典型增生及宫颈鳞状上皮细胞癌组织中表达/例(百分率/%)
注:与正常宫颈比较,①P<0.05;与轻度宫颈不典型增生比较,②P<0.05
表2 宫颈鳞状上皮细胞癌组织皮层肌动蛋白及磷酸化皮层肌动蛋白表达影响因素分析/例(百分率/%)
图1 宫颈鳞状上皮细胞癌细胞增殖情况(a.HeLa细胞;b.Siha细胞)
图2 宫颈鳞状上皮细胞癌细胞中MKi67、PCNA mRNA表达情况(a.HeLa细胞;b.Siha细胞)
图3 划痕实验检测HeLa△CTTN、Siha△CTTN及其对照组细胞迁移能力(a.HeLa细胞;b.Siha细胞)
3 讨论
皮层肌动蛋白过表达与多种类型肿瘤的生物学功能密切相关。如在头颈部肿瘤、直肠癌及胃癌等肿瘤中,皮层肌动蛋白过表达与肿瘤的分期、淋巴结转移、复发及存活率降低等不良预后密切相关[8]。但笔者发现,与正常宫颈组织相比,不典型增生及宫颈鳞状上皮细胞癌组织皮层肌动蛋白表达并未增加,而磷酸化皮层肌动蛋白(Tyr421)和磷酸化皮层肌动蛋白(Tyr466)的表达却在不典型增生及宫颈鳞状上皮细胞癌组织中显著增高。此外,皮层肌动蛋白表达与宫颈鳞状上皮细胞癌患者的临床病理学指标间也无明显相关性。有研究表明,良性组织中存在皮层肌动蛋白表达的缺失,皮层肌动蛋白可在正常组织中表达[9]。也有研究表明,良性肿瘤组织中皮层肌动蛋白表达显著增加,而恶性肿瘤组织中皮层肌动蛋白表达并未增加[10]。提示皮层肌动蛋白的表达可能在不同的组织类型及器官,有着不同的生物学功能。
图4 体外侵袭实验检测 HeLa△CTTN、Siha△CTTN及其对照组细胞的侵袭能力
皮层肌动蛋白磷酸化与细胞移动性及转移性密切相关[4]。有研究表明,Src介导的磷酸化皮层肌动蛋白过表达对细胞移动能力的影响比皮层肌动蛋白过表达更重要,转染突变型皮层肌动蛋白后,对细胞移动能力没有明显影响,但阻断皮层肌动蛋白的酪氨酸磷酸化后,细胞移动能力显著降低[11-13]。本研究通过免疫细胞化学检测,筛选两种高表达皮层肌动蛋白及磷酸化皮层肌动蛋白的宫颈鳞状上皮细胞癌细胞株,并观察到正常细胞在干扰皮层肌动蛋白后,皮层肌动蛋白及磷酸化皮层肌动蛋白同时下调,且其生物学行为有显著变化。但皮层肌动蛋白在正常、不典型增生及宫颈鳞状细胞癌组织中表达无明显差异,且其表达与宫颈鳞状上皮细胞癌患者的临床病理学指标间也无显著相关性,笔者推测皮层肌动蛋白在被磷酸化前,对宫颈鳞状细胞癌可能无重要作用。笔者发现,在宫颈鳞状细胞癌患者中,皮层肌动蛋白磷酸化与T分期及淋巴结转移密切相关。结果提示,磷酸化皮层肌动蛋白表达在宫颈鳞状细胞癌发生发展中起重要作用。
磷酸化皮层肌动蛋白在肿瘤的发生、发展过程中的作用机制尚不明确。作为F-肌动蛋白相关蛋白,皮层肌动蛋白在体外将F-肌动蛋白交联成网状结构。酪氨酸磷酸化可抑制CTTN蛋白交联F-肌动蛋白的能力,但其是否会影响CTTN蛋白交联肌动蛋白的能力仍存在争议[14-15]。有关磷酸化皮层肌动蛋白在宫颈鳞状细胞癌中的作用机制有待于进一步研究。
综上所述,皮层肌动蛋白及磷酸化皮层肌动蛋白的下调,可显著降低宫颈鳞状上皮细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。磷酸化皮层肌动蛋白与宫颈鳞状细胞癌的发生与发展密切相关。